Calcium Phosphate transfection 방법을 이용한 pseudo-typed H5 조류 인플루엔자 바이러스의 제조 및 항체 중화 활성 측정
Summary
여기에서는 유사 바이러스 패키징 및 항체 중화 활성 측정을 위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통의 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 독감 발병을 일으키고 있습니다. 때때로 인간도 희생되어 사망률이 높습니다. 그럼에도 불구하고 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실에서 처리되어야 한다는 점을 고려할 때 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 H5 HPAI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구임이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 유사바이러스 중화 분석의 절차와 중요한 단계를 설명합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다.
Introduction
1996년 이래로 A/goose/Guangdong/1/96 계통 고병원성 조류 인플루엔자(HPAI) H5 바이러스는 가금류와 야생 조류에서 지속적인 독감 발병을 일으켜 전 세계 가금류 산업에서 막대한 사회경제적 손실을 초래했습니다. 때로는 인간도 감염되어 높은 치사율 1,2에 직면합니다. 그러나 HPAI 바이러스 연구는 생물 안전성 레벨 3 실험실 밖에서 처리 할 수 없기 때문에 종종 방해를 받습니다. 이 문제를 해결하기 위해 H5 HPAI 연구의 일부 실험에서 유사 바이러스가 야생형 바이러스의 대안으로 채택되었습니다. 슈도바이러스는 생물안전성 레벨 2 실험실에서 실습할 수 있을 만큼 안전합니다.
H5 HPAI 슈도바이러스는 대리 바이러스 코어, 인플루엔자 바이러스의 표면 당단백질이 있는 지질 외피 및 리포터 유전자로 구성된 키메라 바이러스에 속합니다. 슈도바이러스 코어는 일반적으로 렌티바이러스 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 쥐 백혈병 바이러스(MLV) 및 수포성 구내염 바이러스(VSV)와 같은 레트로바이러스에서 파생됩니다.3. 특히, HIV-1 패키징 시스템은 인플루엔자 슈도바이러스를 생산하기 위해 널리 사용되며, 여기서 제공되는 주요 유전자는 gag 및 pol입니다. HIV gag 유전자는 핵심 단백질을 발현합니다. pol 유전자는 인테그라제 및 역전사효소를 발현하며, 둘 다 형질도입된 세포에서 리포터 유전자의 발현에 필요합니다. 대리 바이러스의 게놈을 모방한 리포터 유전자는 RNA 형태로 유사바이러스 코어에 흡수됩니다. 리포터 유전자는 숙주 세포에서 단백질을 발현합니다. 리포터 유전자의 유전자 발현 수준은 슈도바이러스 감염 효율을 측정하는데 사용될 수 있다 3,4. 1차 리포터는 형질도입된 세포에서 상대 발광 단위(RLU) 또는 상대 루시페라아제 활성(RLA)을 측정하기 위한 반딧불이 루시페라아제입니다. lacZ, Gaussia, Renilla luciferase 와 같은 다른 리포터들도 사용되지만 그 정도는 적습니다5.
슈도바이러스는 H5 HAPI 바이러스에 대한 중화 항체를 연구하는 데 이상적인 도구입니다. 중화 항체 효능을 측정하기 위해, 슈도바이러스 중화(PN)분석법(6)이 사용된다. 헤마글루티닌(HA)과 뉴라미니다아제(NA)는 인플루엔자 A 바이러스 7,8의 표면에 있는 당단백질입니다. HA는 수용체 결합을 위한 구형 헤드 도메인과 막 융합을 위한 줄기 도메인으로 구성됩니다. NA 단백질은 바이러스 방출을 촉진하는 시알리다아제 활성을 가지고 있습니다 7,8. PN 분석은 HA 단백질에 대한 중화 항체를 측정할 수 있습니다. HA의 머리 및 줄기 영역으로 향하는 중화 항체는 또한 바이러스 부착 및 진입 분석에 의해 검출될 수 있다. 야생형 바이러스에 비해 유사 바이러스 중화 실험은 검출 값이 더 민감하고 레벨 2 생물 안전 실험실에서 안전하게 처리 할 수 있으며 일반적으로 실제로 작동하기가 더 쉽습니다.
이 프로토콜은 H5 HPAI 유사바이러스 제제 및 PN 분석의 절차와 중요한 단계를 자세히 제시합니다. 또한 이러한 분석의 문제 해결, 제한 및 수정에 대해 설명합니다. 본 연구에서는 H5N1 HPAI 바이러스의 A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH) 균주를 예로 들어 설명하였다. 분석에 사용되는 면역 혈청을 얻기 위해, 이 프로토콜은 마우스를 면역화하기 위한 면역원으로서 TH 균주로부터 유래된 HA 단백질을 선택하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
HEK293FT 세포는 일반적으로 슈도바이러스를 생산하기 위한 포장 세포로 사용됩니다. 정기적인 마이코플라스마 검출은 세포 배양 중에 필수적입니다. 마이코플라스마 오염은 슈도바이러스 수율을 급격히 감소시킬 수 있으며 때로는 0에 가까울 수 있습니다. 다른 오염과 비교할 때, 마이코플라스마 오염은 세포 배양 배지의 pH 값 변화 또는 탁도를 유발하지 않습니다. 고농도의 마이코 플라스마조차?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 장쑤성 혁신 역량 강화 프로젝트(BM2020019), 선전 과학 기술 프로젝트(No. JSGG20200225150702770), 중국과학원(XDB29030103)의 전략적 우선 연구 프로그램, 광동 과학 기술 프로젝트(No. 2020B1111340076) 및 Shenzhen Bay Laboratory Open Research Program(No. SZBL202002271003).
Materials
| 1% Chiken Erythrocyte | Bio-channel | BC-RBC-C001 | Reagent |
| 96-well cell culture plates (flat-bottom) | Thermo fisher scientific | 167008 | consumable material |
| 96-well cell culture plates (round-bottom) | Thermo fisher scientific | 163320 | consumable material |
| Allegra X-15R | Beckman coulter | — | Equipment/Centrifuge |
| BD Insulin Syringes | BD | 324910 | consumable material |
| Calcium Chloride Anhydrous | AMRESCO | 1B1110-500G | Reagent |
| chloroquine diphosphate | Selleck | S4157 | Reagent |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Reagent |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | Reagent |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Cell line |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Reagent |
| HIV-1 p24 Antigen ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Reagent kit |
| Luciferase Assay System Freezer Pack | Promega | E4530 | Reagent kit |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Cell line |
| Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | consumable material |
| Nunc Conical Centrifuge Tubes 50 mL | Thermo fisher scientific | 339652 | consumable material |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consumable material |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Reagent |
| Pipette Tips (10 μL) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | consumable material |
| Pipette Tips (100 μL) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | consumable material |
| Pipette Tips (1000 μL) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | consumable material |
| Serological pipets (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | consumable material |
| Serological pipets (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | consumable material |
| Trypsin/EDTA | Gibco | 25200-072 | Reagent |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientific | — | Equipment/Microplate reader |
| Water Jacket Incubator | Thermo fisher scientific | 3111 | Equipment/Cell incubator |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | 57-33-0 | Reagent |
References
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