Nous décrivons ici un protocole pour l’emballage des pseudovirus et la mesure de l’activité neutralisante des anticorps.
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Article de méthode
Préparation de virus pseudo-typés H5 de la grippe aviaire avec procédé de transfection de phosphate de calcium et mesure de l’activité neutralisante des anticorps
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Dans cet article
Résumé
Résumé
Depuis 1996, les virus H5 de la lignée A/oie/Guangdong/1/96-lignée hautement pathogène (IAHP) sont à l’origine d’épidémies de grippe chez les volailles et les oiseaux sauvages. Parfois, les humains en sont également victimes, ce qui entraîne une mortalité élevée. Néanmoins, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle doit être traitée dans des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont adoptés comme alternative aux virus de type sauvage dans certaines expériences d’études IAHP H5. Les pseudovirus s’avèrent être les outils idéaux pour étudier les anticorps neutralisants contre les virus IAHP H5. Ce protocole décrit les procédures et les étapes critiques des préparations de pseudovirus IAHP H5 et des tests de neutralisation des pseudovirus. En outre, il traite du dépannage, de la limitation et des modifications de ces tests.
Introduction
Depuis 1996, les virus H5 de la grippe aviaire hautement pathogène (IAHP) de la lignée A/oie/Guangdong/1/96 sont à l’origine d’épidémies de grippe continuelles chez les volailles et les oiseaux sauvages, ce qui représente d’énormes pertes socio-économiques dans l’industrie mondiale de la volaille. Parfois, les humains sont également infectés par elle, confrontés à un taux de mortalité élevé 1,2. Cependant, la recherche sur les virus de l’IAHP est souvent entravée, étant donné qu’elle ne peut pas être traitée en dehors des laboratoires de niveau de biosécurité 3. Pour résoudre ce problème, les pseudovirus sont ....
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Protocole
Toutes les opérations expérimentales liées aux pseudovirus ont été réalisées sous condition ABSL2 à l’Institut Pasteur de l’Académie chinoise des sciences de Shanghai (IPS, CAS). Les expériences sur les animaux ont été réalisées sur la base des protocoles sur les animaux approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’IPS, CAS.
1. Emballage de pseudovirus avec transfection de phosphate de calcium
- Fabriquer des suspensions unicellulaires de cellules HEK293FT (9 x 105 par mL) dans un milieu DMEM complet (tableau 1). Ajouter 10 mL des suspensions unicellula....
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Résultats
Expression des protéines HA, NA et VIH-1 p24 du pseudovirus de la grippe
Pour déterminer l’efficacité de l’emballage viral, les stocks de pseudovirus grippaux ont d’abord été détectés par le test HA (figure 2A). Les unités d’HA par millilitre de pseudovirus de la grippe sont de 643 (tableau 3). Le test Western blot et les tests ELISA sandwich ont été utilisés pour tester l’expression des protéines p24 HA, NA et VIH-1. Ensuite, les rapports de l’unité HA e.......
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Discussion
HEK293FT cellules sont généralement utilisées comme cellules d’emballage pour produire des pseudovirus. Une détection régulière des mycoplasmes est essentielle lors de la culture cellulaire. La contamination par les mycoplasmes peut diminuer considérablement les rendements de pseudovirus et parfois proche de zéro. Par rapport à d’autres contaminations, les contaminations par mycoplasmes n’entraînent pas de changements de la valeur du pH ou de turbidité du milieu de culture cellulaire. Même une forte concentration de myco.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions de recherche du Projet de renforcement des capacités d’innovation de la province du Jiangsu (BM2020019), du Projet scientifique et technologique de Shenzhen (No. JSGG20200225150702770), le Programme de recherche prioritaire stratégique de l’Académie chinoise des sciences (XDB29030103), le Projet scientifique et technologique du Guangdong (n° 2020B1111340076) et le Programme de recherche ouvert du Laboratoire de la baie de Shenzhen (No. SZBL202002271003).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 % Érythrocytes de l’enfant | Bio-canal | BC-RBC-C001 | Réactif |
| Plaques de culture cellulaire à 96 puits (à fond plat) | Thermo fisher scientific | 167008 | consommable Plaques |
| culture cellulaire à 96 puits (à fond rond) | Thermo fisher scientific | 163320 | Consommable |
| Allegra X-15R | Beckman soc | -- | Équipement/Centrifugeuse |
| BD Seringues à insuline | BD | 324910 | Consommable |
| Chlorure de calcium Anhydre | AMRESCO | 1B1110-500G | Réactif |
| diphosphate de chloroquine | Selleck | S4157 | Réactif |
| Dulbecco' s Medium Eagle modifié (DMEM) | Gibco | 12100-046 | Réactif |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 16000-044 | Réactif |
| HEK293FT | Gibco | R700-07 | Lignée cellulaire |
| HEPES FREE ACID | AMRESCO | 0511-250G | Réactif |
| HIV-1 p24 Antigène ELISA | ZeptoMetrix | 801111 | Kit de réactifs |
| Système de dosage de la luciférase Congélateur Pack | Promega | E4530 | Kit de réactifs |
| MDCK.1 | ATCC | CRL-2935 | Lignée cellulaire |
| Tubes de microcentrifugation 1,5 mL | Thermo fisher scientific | 509-GRD-Q | Consommable |
| Tubes à centrifuger coniques Nunc 15 mL | Thermo fisher scientific | 339650 | Consommable |
| Nunc Tubes à centrifuger coniques 50 mL Thermo | fisher scientific | 339652 | consommables |
| Nunc EasYFlask 75 cm2 | Thermo fisher scientific | 156499 | consommables |
| Pénicilline-Streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| Réactif Pointes de pipette (10 &mu ; L) | Thermo fisher scientific | TF102-10-Q | Consommable |
| Pointes de pipette (100 &mu ; L) | Thermo fisher scientific | TF113-100-Q | Consommable |
| Pointes de pipette (1000 &mu ; L) | Thermo fisher scientific | TF112-1000-Q | Consommable |
| Pipettes sérologiques (5 mL) | Thermo fisher scientific | 170355N | Consommables Pipettes |
| sérologiques (10 mL) | Thermo fisher scientific | 170356N | Consommables |
| Trypsine/EDTA | Gibco | 25200-072 | Réactif |
| Varioskan Flash | Thermo fisher scientifique | -- | Équipement/Lecteur de microplaques |
| Enveloppe d’eau Incubateur | Thermo fisher scientifique | 3111 | Équipement/Cellule Incubateur |
| Pentobarbital sel de sodium | Sigma | 57-33-0 | Réactif |
Références
- Wang, G., et al. DNA prime and virus-like particle boost from a single H5N1 strain elicits broadly neutralizing antibody responses against head region of h5 hemagglutinin. The Journal of Infectious Diseases. 209 (5), 676-685 (2014).
- Wang, G., Yin, R., Zhou, P., Ding, Z.
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