시험관 내에서 인간 망막 모세포종 재건
Summary
우리는 인간 배아 줄기 세포 (hESC)에 이중 대립 유전자 RB1 돌연변이를 도입하여 인간 망막 모세포종 (RB)을 생성하는 방법을 설명합니다. RB 세포주는 또한 접시에서 단리된 RB를 사용하여 성공적으로 배양될 수 있었다.
Abstract
인간 RB는 소아암으로 치료를 시행하지 않으면 치명적입니다. RB는 설치류 모델에서 비교적 드문 원뿔 전구체에서 유래하기 때문에 인간과 설치류의 종간 차이와 관련하여 인간에서 파생 된 질병 모델은 인간 RB의 메커니즘을 밝히고 치료 대상을 찾는 데 더 유리합니다. 본원에서, 프로토콜은 각각 이대립유전자 RB1 점 돌연변이(RB1 Mut/Mut) 및 RB1 녹아웃 돌연변이(RB1–/-)를 갖는 2개의 유전자 편집된 hESC 계통의 생성을 기술한다. 망막 발달 과정에서 RB의 형성이 관찰됩니다. RB 세포주는 또한 RB 오가노이드로부터 분리함으로써 확립된다. 전체적으로 2D 및 3D 결합 분화 프로토콜을 사용하여 유전자 편집 hESC 라인을 망막 오가노이드로 분화함으로써 우리는 접시에서 인간 RB를 성공적으로 재구성하고 원뿔 전구체 기원을 확인했습니다. 망막 모세포종의 발생, 증식 및 성장을 관찰하고 새로운 치료제를 추가로 개발하는 데 유용한 질병 모델을 제공 할 것입니다.
Introduction
인간 망막 모세포종 (RB)은 망막 원뿔 전구체 1,2,3에서 유래 한 희귀하고 치명적인 종양이며, 어린 시절에 가장 흔한 유형의 안구 내 악성 종양입니다4. RB1 유전자의 동형접합체 불활성화는 RB5에서 개시되는 유전적 병변이다. 그러나, RB1 돌연변이를 갖는 마우스는 망막 종양2를 형성하지 못한다. 마우스 종양은 Rb1 돌연변이 및 다른 유전자 변형의 조합으로 생성 될 수 있지만, 여전히 인간 RB6의 특징이 부족합니다. 망막 오가노이드 분화의 발달 덕분에, 인간 RB1의 특성을 나타내는 hESC 유래 RB를 얻을 수 있었다.
망막 오가노이드 분화를 위한 수많은 프로토콜이 지난 10년 동안 확립되었으며, 여기에는 2D7, 3D8, 2D 및 3D9의 조합이 포함됩니다. 인간 RB를 생성하기 위해 여기에서 사용되는 방법은 부착 문화와 부유 문화의 통합입니다9. RB1 돌연변이 된 hESC를 망막 오가노이드로 분화시킴으로써 RB의 형성은 약 45 일에 검출 된 다음 약 60 일에 빠르게 증식합니다. 90일째에, RBs의 단리 및 RB 세포주의 생성이 가능하다; 또한, RB는 120일째에 거의 모든 망막 오가노이드를 둘러싸고 있다.
hESC 유래 RB는 RB의 기원, 종양 발생 및 치료법을 탐구하기 위한 혁신적인 모델입니다. 이 프로토콜에서는 유전자 편집 hESC의 생성, RB의 분화 및 RB에 대한 특성화가 상세히 설명된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 망막 모세포종 (RB)은 RB1 의 불 활성화와 Rb 단백질의 기능 장애로 인해 발생합니다. 이 프로토콜에서 RB1-KO hESC는 접시에서 RB를 생성하는 중추적인 단계입니다. RB1-/- hESC를 사용하더라도 망막 오가노이드 분화 방법으로 인해 RB 형성이 없을 가능성이 있습니다10. 이 프로토콜에서 순응 문화에서 부유 문화로의 이전은 차별화 과정에서 필수적입니다…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
모든 도움을 주신 502 팀에 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받고 있습니다.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Biologie du développement. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
