विट्रो में मानव रेटिनोब्लास्टोमा का पुनर्निर्माण
Summary
हम मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में बाइएलील आरबी 1 उत्परिवर्तन पेश करके मानव रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) उत्पन्न करने के लिए एक विधि का वर्णन करते हैं। आरबी सेल लाइनों को एक डिश में पृथक आरबी का उपयोग करके सफलतापूर्वक संवर्धित किया जा सकता है।
Abstract
मानव आरबी बाल चिकित्सा कैंसर है, जो घातक है यदि कोई उपचार नहीं दिया जाता है। चूंकि आरबी शंकु अग्रदूतों से उत्पन्न होता है, जो कृंतक मॉडल में अपेक्षाकृत दुर्लभ है, इस बीच मनुष्यों और कृन्तकों के बीच अंतर-प्रजाति अंतर के बारे में, मनुष्यों से प्राप्त एक रोग मॉडल मानव आरबी के तंत्र को उजागर करने और चिकित्सा के लक्ष्यों की तलाश के लिए अधिक फायदेमंद है। इसमें, प्रोटोकॉल क्रमशः एक द्विगुणित आरबी 1 बिंदु उत्परिवर्तन (आरबी 1 म्यूट / म्यूट) और आरबी 1 नॉकआउट म्यूटेशन (आरबी 1-/-) के साथ दो जीन-संपादित एचईएससी लाइनों की पीढ़ी का वर्णन करता है। रेटिना विकास की प्रक्रिया के दौरान, आरबी का गठन देखा जाता है। आरबी ऑर्गेनोइड्स से अलग करके आरबी सेल लाइनें भी स्थापित की जाती हैं। कुल मिलाकर, जीन-संपादित एचईएससी लाइनों को 2 डी और 3 डी संयुक्त भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अंतर करके, हमने सफलतापूर्वक एक डिश में मानव आरबी का पुनर्निर्माण किया है और इसके शंकु-अग्रदूत मूल की पहचान की है। यह रेटिनोब्लास्टोमा उत्पत्ति, प्रसार और विकास के साथ-साथ नए चिकित्सीय एजेंटों को विकसित करने के लिए एक सहायक रोग मॉडल प्रदान करेगा।
Introduction
मानव रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) रेटिना शंकु-अग्रदूतों से प्राप्त एक दुर्लभ, घातक ट्यूमर है 1,2,3, बचपन में इंट्राओकुलर दुर्भावना का सबसे आम प्रकार है। आरबी 1 जीन की होमोजीगस निष्क्रियता आरबी5 में आनुवंशिक घाव की शुरुआत है। हालांकि, आरबी 1 उत्परिवर्तन वाले चूहे रेटिना ट्यूमर2 बनाने में विफल रहते हैं। यद्यपि माउस ट्यूमर आरबी 1 उत्परिवर्तन और अन्य आनुवंशिक संशोधनों के संयोजन के साथ उत्पन्न हो सकते हैं, फिर भी उनमें मानव आरबी6 की विशेषताओं की कमी है। रेटिना ऑर्गेनॉइड भेदभाव के विकास के लिए धन्यवाद, एचईएससी-व्युत्पन्न आरबी प्राप्त किया जा सकता है, जो मानव आरबी1 के पात्रों को प्रदर्शित करता है।
पिछले दशक में रेटिना ऑर्गनॉइड भेदभाव के लिए कई प्रोटोकॉल स्थापित किए गए हैं, जिनमें 2 डी7, 3 डी8 और 2 डी और 3 डी 9 का संयोजन शामिलहै। मानव आरबी उत्पन्न करने के लिए यहां उपयोग की जाने वाली विधि अनुयायी संस्कृति और फ्लोटिंग संस्कृतिका समेकन है। आरबी 1 उत्परिवर्तित एचईएससी को रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अलग करके, आरबी के गठन का पता लगभग 45 वें दिन लगाया जाता है, और फिर यह लगभग 60 वें दिन तेजी से बढ़ता है। 90 वें दिन, आरबी का अलगाव, और आरबी सेल लाइन का उत्पादन संभव है; इसके अलावा, आरबी 120 वें दिन लगभग सभी रेटिना ऑर्गेनोइड्स को घेरता है।
एचईएससी-व्युत्पन्न आरबी आरबी के लिए उत्पत्ति, ट्यूमरजेनिसिस और उपचार की खोज के लिए एक अभिनव मॉडल है। इस प्रोटोकॉल में, जीन-संपादन एचईएससी की पीढ़ी, आरबी के भेदभाव और आरबी के लिए लक्षण वर्णन विस्तार से वर्णित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव रेटिनोब्लास्टोमा (आरबी) आरबी 1 की निष्क्रियता और आरबी प्रोटीन की शिथिलता के कारण होता है। इस प्रोटोकॉल में, आरबी 1-केओ एचईएससी एक डिश में आरबी की पीढ़ी के लिए महत्वपूर्ण कदम है। जबकि आरबी 1<…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम 502 टीम को सभी मदद के लिए धन्यवाद देते हैं। यह काम आंशिक रूप से बीजिंग म्यूनिसिपल नेचुरल साइंस फाउंडेशन (जेड 200014) और चीन के राष्ट्रीय कुंजी आर एंड डी कार्यक्रम (2017वाईएफए0105300) द्वारा समर्थित है।
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
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