Rekonstruera humant retinoblastom in vitro

Summary

Vi beskriver en metod för att generera humant retinoblastom (RB) genom att införa bialleliska RB1-mutationer i mänskliga embryonala stamceller (hESC). RB-cellinjer kan också framgångsrikt odlas med hjälp av den isolerade RB i en skål.

Abstract

Mänsklig RB är barncancer, som är dödlig om ingen behandling ges. Eftersom RB härstammar från konprekursorer, vilket är relativt sällsynt i gnagarmodeller, är det under tiden när det gäller skillnaderna mellan arter mellan människor och gnagare, en sjukdomsmodell som härrör från människor mer fördelaktig för att avslöja mekanismerna för mänsklig RB och söka terapimålen. Häri beskriver protokollet genereringen av två genredigerade hESC-linjer med en biallelic RB1-punktmutation (RB1 Mut/^Mut) respektive en RB1 knockout-mutation (RB1–^/-). Under processen med retinal utveckling observeras bildandet av RB. RB-cellinjerna etableras också genom att separera från RB-organoiderna. Sammantaget, genom att differentiera de genredigerade hESC-linjerna i retinala organoider med hjälp av ett 2D- och 3D-kombinerat differentieringsprotokoll, har vi framgångsrikt rekonstruerat den mänskliga RB i en maträtt och identifierat dess kon-föregångare ursprung. Det skulle ge en användbar sjukdomsmodell för att observera retinoblastomens uppkomst, proliferation och tillväxt samt vidareutveckla nya terapeutiska medel.

Introduction

Humant retinoblastom (RB) är en sällsynt, dödlig tumör som härrör från näthinnekonprekursorerna ^1,2,3, är den vanligaste typen av intraokulär malignitet i barndomen⁴. Homozygot inaktivering av RB1-genen är den initierande genetiska lesionen i RB⁵. Möss med RB1-mutationer misslyckas dock med att bilda näthinnetumören². Även om mustumörerna kan genereras med kombinationen av Rb1-mutationer och andra genetiska modifieringar, saknar de fortfarande funktionerna hos human RB⁶. Tack vare utvecklingen av retinal organoiddifferentiering kunde den hESC-härledda RB erhållas, som visar karaktärerna hos human RB¹.

Många protokoll för retinal organoiddifferentiering har upprättats under det senaste decenniet, inklusive 2D⁷, 3D⁸ och en kombination av 2D och 3D⁹. Metoden som används här för att generera den mänskliga RB är konsolideringen av vidhäftande kultur och flytande kultur⁹. Genom att differentiera RB1-muterat hESC till retinala organoider detekteras bildandet av RB runt dag 45, och sedan sprider det sig snabbt runt dag 60. På dag 90 är isolering av RB och generering av RB-cellinjen möjlig; dessutom omger RB nästan alla retinala organoider vid dag 120.

hESC-härledd RB är en innovativ modell för att utforska ursprung, tumorigenes och behandlingar för RB. I detta protokoll beskrivs genereringen av genredigerings-hESC, differentieringen av RB och karakteriseringen för RB i detalj.

Protocol

Denna studie är godkänd av den institutionella etikkommittén vid Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC erhålls från WiCell Research Institute. 1. Generering av RB1-muterad hESC CRISPR/Cas9 målvektor för knockout (KO) av RB1. Designa ett par sgRNA. För ablation av RB1, rikta in dig på den första exonen av denna gen. Den främre primersekvensen är CACCGCGGTGGCGGCCGTTTTTCGG, och den omvända primersekvensen är AAAC…

Representative Results

Förfarandet för RB-generering belyses i figur 1, som kombinerar den vidhäftande och flytande kulturen. Det var möjligt att skörda den mänskliga RB från RB1-KO hESC och erhålla RB-cellinjen genom att isolera RB-organoiderna. Här ger protokollet detaljer om differentieringen i olika steg (figur 2). Ihåliga sfärer bildas under de första 3 dagarna som fäster vid odlingsytan och sedan expanderar (…

Discussion

Humant retinoblastom (RB) orsakas av inaktivering av RB1 och dysfunktion av Rb-protein. I detta protokoll är RB1-KO hESC det avgörande steget för generering av RB i en maträtt. Även med RB1–^/- hESC är det möjligt att det inte finns någon RB-bildning på grund av metoderna för retinal organoiddifferentiering¹⁰. I detta protokoll är överföringen från vidhäftande kultur till flytande kultur avgörande i differentieringsprocessen. Tätheten av cystor…

Materials

2-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023
Anti-ARR3	Sigma	HPA063129	Antibody
Anti-CRX (M02)	Abnove	ABN-H00001406-M02	Antibody
Anti-Ki67	Abcam	ab15580	Antibody
Anti-Syk (D3Z1E)	Cell Signaling Technology	13198	Antibody
BbsI	NEB	R3539S	Restriction enzymes
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	7923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F-12-GlutaMAX	Gibco	10565-042
DMSO	Sigma	D2650
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells	Biological Industry	04-002-1A
Glutamine	Gibco	35050-061
Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)	Gibco	11765-054
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)	Sigma	M7145
Neurobasal Medium	Gibco	21103-049
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S	Lonza	V4XP-3032	Nucleofection kit
Pen Strep	Gibco	15140-122
Puromycin	Gene Operation	ISY1130- 0025MG
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104
ncEpic-hiPSC/hESC culture medium	Nuwacell	RP01001	ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1
Growth factor reduced basement membrane matrix	BD	356231	Matrigel in 1.2.1
Cell dissociation enzyme	Gibco	12563-011	TrypLE Express in 1.2.8
RNeasy Midi Kit	QIAGEN	75144
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
Supplement A	Life Technologies	17502-048	N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I
Supplement B	Life Technologies	17105-041	B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III
T4 Polynucleotide Kinase	Life Technologies	EK0032
Taurine	Sigma	T-8691-25G
Y-27632 2HCl	Selleck	S1049
pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro	Addgene	42230
Nucleofector 4D	Lonza
RPMI	Sigma	R0883-500ML