İnsan Retinoblastomunu In Vitro Yeniden İnşa Etmek
Summary
İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC) bialelik RB1 mutasyonlarını tanıtarak insan retinoblastomu (RB) üretmek için bir yöntem tanımladık. RB hücre hatları, bir tabakta izole RB kullanılarak başarılı bir şekilde kültürlenebilir.
Abstract
İnsan RB’si pediatrik kanserdir ve tedavi uygulanmazsa öldürücüdür. RB, kemirgen modellerinde nispeten nadir görülen koni öncüllerinden kaynaklandığından, insanlar ve kemirgenler arasındaki türler arası farklılıklarla ilgili olarak, insanlardan türetilen bir hastalık modeli, insan RB’sinin mekanizmalarını ortaya çıkarmak ve tedavinin hedeflerini aramak için daha faydalıdır. Burada protokol, sırasıyla bialelik RB1 nokta mutasyonu (RB1 Mut / Mut) ve bir RB1 nakavt mutasyonu (RB1–/-) ile iki gen düzenlenmiş hESC hattının oluşumunu açıklamaktadır. Retina gelişimi sürecinde RB oluşumu gözlenir. RB hücre hatları ayrıca RB organoidlerinden ayrılarak da kurulur. Toplamda, gen düzenlenmiş hESC hatlarını retinal organoidlere 2D ve 3D kombine farklılaşma protokolü kullanarak farklılaştırarak, insan RB’sini bir tabakta başarıyla yeniden yapılandırdık ve koni-öncü kökenini belirledik. Retinoblastoma oluşumunu, proliferasyonunu ve büyümesini gözlemlemek ve yeni terapötik ajanların daha da geliştirilmesi için yararlı bir hastalık modeli sağlayacaktır.
Introduction
İnsan retinoblastomu (RB), retinal koni öncüllerinden 1,2,3 köken alan nadir görülen, ölümcül bir tümördür ve çocukluk çağında en sık görülen göz içi malignite tipidir 4. RB1 geninin homozigot inaktivasyonu, RB5’te başlatıcı genetik lezyondur. Bununla birlikte, RB1 mutasyonlarına sahip fareler retinal tümör2’yi oluşturamaz. Fare tümörleri Rb1 mutasyonlarının ve diğer genetik modifikasyonların kombinasyonu ile üretilebilse de, hala insan RB6’nın özelliklerinden yoksundurlar. Retinal organoid farklılaşmasının gelişmesi sayesinde, insan RB1’in karakterlerini gösteren hESC türevi RB elde edilebilir.
Son on yılda, retinal organoid farklılaşması için 2D7, 3D8 ve 2D ve 3D9’un bir kombinasyonu da dahil olmak üzere çok sayıda protokol oluşturulmuştur. Burada insan RB’sini üretmek için kullanılan yöntem, yapışkan kültürün ve yüzen kültürün konsolidasyonudur9. RB1 mutasyona uğramış hESC’yi retinal organoidlere ayırarak, RB oluşumu yaklaşık 45. günde tespit edilir ve daha sonra 60. günde hızla çoğalır. 90. günde, RB’lerin izolasyonu ve RB hücre hattının oluşturulması mümkündür; Ayrıca, RB 120. günde neredeyse tüm retinal organoidleri çevreler.
hESC kaynaklı RB, RB’nin kökenini, tümörigenezini ve tedavilerini araştırmak için yenilikçi bir modeldir. Bu protokolde, gen düzenleme hESC’nin üretimi, RB’nin farklılaşması ve RB için karakterizasyon ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan retinoblastomu (RB), RB1’in inaktivasyonu ve Rb proteininin işlev bozukluğundan kaynaklanır. Bu protokolde, RB1-KO hESC, bir tabakta RB üretimi için çok önemli bir adımdır. RB1-/- hESC ile bile, retinal organoid farklılaşma10 yöntemlerine bağlı olarak RB oluşumunun olmaması mümkündür. Bu protokolde, yapışkan kültürden yüzen kültüre geçiş, farklılaşma sürecinde esastır. Kistlerin yoğunluğu, pluripotent kök hücre tipler…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tüm yardımları için 502 ekibine teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Pekin Belediyesi Doğa Bilimleri Vakfı (Z200014) ve Çin Ulusal Anahtar Ar-Ge Programı (2017YFA0105300) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Anti-ARR3 | Sigma | HPA063129 | Antibody |
| Anti-CRX (M02) | Abnove | ABN-H00001406-M02 | Antibody |
| Anti-Ki67 | Abcam | ab15580 | Antibody |
| Anti-Syk (D3Z1E) | Cell Signaling Technology | 13198 | Antibody |
| BbsI | NEB | R3539S | Restriction enzymes |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F-12-GlutaMAX | Gibco | 10565-042 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Glutamine | Gibco | 35050-061 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12) | Gibco | 11765-054 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X) | Sigma | M7145 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit S | Lonza | V4XP-3032 | Nucleofection kit |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| Puromycin | Gene Operation | ISY1130- 0025MG | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| ncEpic-hiPSC/hESC culture medium | Nuwacell | RP01001 | ncEpic-hiPSC/hESC culture medium in 1.2.1 |
| Growth factor reduced basement membrane matrix | BD | 356231 | Matrigel in 1.2.1 |
| Cell dissociation enzyme | Gibco | 12563-011 | TrypLE Express in 1.2.8 |
| RNeasy Midi Kit | QIAGEN | 75144 | |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| Supplement A | Life Technologies | 17502-048 | N-2 Supplement (100X), liquid, supplemet in medum I |
| Supplement B | Life Technologies | 17105-041 | B-27 Supplement (50X),liquid, supplemet in medum I,II,III |
| T4 Polynucleotide Kinase | Life Technologies | EK0032 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Y-27632 2HCl | Selleck | S1049 | |
| pX330-U6- Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro | Addgene | 42230 | |
| Nucleofector 4D | Lonza | ||
| RPMI | Sigma | R0883-500ML |
References
- Liu, H., et al. Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).
- Singh, H. P., et al. Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).
- Xu, X. L., et al. Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours. Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).
- Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. The biology of retinoblastoma. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).
- Benavente, C. A., Dyer, M. A. Genetics and epigenetics of human retinoblastoma. Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).
- Wu, N., et al. A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence. The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).
- Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid. Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).
- Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Biologie du développement. 462 (2), 197-207 (2020).
- Dimaras, H., Corson, T. W. Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review. Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).
- Xu, X. L., et al. Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling. Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).
- Qi, D. L., Cobrinik, D. MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation. Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).
