다중 매개 변수 광유체 플랫폼을 사용하여 칼슘 유입 및 HIV-1 감염의 단세포 특성화
Summary
여기서, 우리는 나노 유체 장치에 있는 급성 사건 및 생산적인 HIV-1 감염을 위해 단 하나 세포가 감시되는 프로토콜을 제시합니다. 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의합니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 이미징을 위한 첫번째 방법이다 운동및 분자 상호 작용을 연구하기 위하여.
Abstract
HIV-1은 전 세계적으로 3,700만 명 이상에게 영향을 미치는 만성 감염을 일으킵니다. 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)와 함께 사는 사람들은 항 레트로 바이러스 치료에도 불구하고 만성 염증과 관련된 혼변성을 경험합니다. 그러나 이러한 염증 성 신호는 완전히 특징적이지 않았습니다. 세포 신호 이벤트 및 다운스트림 유전자 발현의 활성화에 대한 초기 진입 이벤트의 역할은 단일 세포 수준에서 포착되지 않았습니다. 여기서 저자는 동적 셀룰러 프로세스의 높은 처리량 분석을 허용하는 사용자 맞춤형 시간 과정을 통해 배양 및 이미지 세포를 배양하는 자동화 된 단일 셀 플랫폼에 살아있는 세포 형광 현미경 검사법의 원리를 적용하는 방법을 설명합니다. 이 분석법은 HIV-1 감염을 즉시 따르는 초기 사건의 단일 세포 살아있는 형광 현미경 검사법, 특히 바이러스에 노출과 형광 기자 바이러스를 사용하여 생산적인 감염의 발달을 수반하는 칼슘의 유입을 추적할 수 있습니다. MT-4 세포는 칼슘에 민감한 염료를 장착하고 나노유체 장치에 있는 격리된 펜에서 배양됩니다. 배양된 세포는 HIV-1 리포터 바이러스(HIV-1 NLCI)에 감염된다. 나노유체 장치 위에 위치한 형광 현미경은 급성 HIV-1 노출 후 8분 의 시간 과정을 통해 칼슘 유입을 측정합니다. HIV-1 생산성 감염은 4일 간격을 통해 동일한 세포에서 측정됩니다. 이 시간 과정의 이미징 데이터는 바이러스 호스트 수용체 상호 작용 및 신호 경로 역학을 정의하기 위해 분석됩니다. 저자는 단일 세포 정렬, 배양, 이미징 및 소프트웨어 자동화가 가능한 새로운 광유체 플랫폼을 사용하여 전통적인 이미징 방법에 대한 통합적이고 확장 가능한 대안을 제시합니다. 이 분석체는 매개 변수의 배열을 측정하는 동안 세포 유형, 고뇌스트 또는 길항제 효과를 포함한 다양한 조건하에서 이벤트의 운동학을 측정할 수 있습니다. 이것은 나노 유체 고처리량 종방향 단세포 배양 및 화상 진찰을 위한 첫번째 확립된 방법입니다: 이 기술은 세포 신호 운동및 동적 분자 상호 작용을 공부하기 위하여 광범위하게 적응될 수 있습니다.
Introduction
만성 염증은 HIV와 관련된 초기 이환율및 사망률1,2,3의주요 원인입니다. HIV가 염증 신호를 활성화할 수 있는 여러 메커니즘이 있으며, 최근 증거는 칼슘 게이팅 아데노신 삼위산염(ATP) 수용체3,4,4,5,6,7,8,9,10인HIV 항목에서 P2X 수용체에 대한 역할을 시사한다. 퓨리너기체 수용체의 P2X 특수형(P2XR)은 이 염증의 중요한 촉진자가 될 수 있다. 그러나, HIV-P2XR 상호 작용의 분자 기계장치는 크게 알려지지 않으며 초기 및 늦은 HIV-1 바이러스 성 수명 주기 단계에 영향을 미칠 수 있습니다. HIV 관련 만성 염증을 유발하는 경로와 운동학을 정의하는 것은 HIV 를 가진 사람들을 위한 치료 옵션을 발전시키는 데 중요합니다.
HIV-1이 P2X 수용체를 직접 고통스럽게 하는지 여부를 평가하려면 P2XR 활성화 및 HIV-1 감염을 병렬로 측정해야 합니다. P2XR 활성 및 HIV-1 감염의 분석이 독립적으로 확립되었습니다: 세포 칼슘 유입은 P2XR 활성화의 지표이며, HIV-1 생산적인 감염은 RNA 풍부에 의해 정량화될 수 있다. 플루오-4 칼슘 에 민감한 염료로 칼슘 유입의 형광 검출이 가능하며, HIV-1 감염은 mCherry 형광 기자 바이러스 HIV-NLCI11,12,13,14,15로시각화될 수 있다.
P2X 활성화(급성 세포 칼슘 유입) 및 HIV-1 감염(HIV-1 RNA 합성)의 이러한 지표는 다른 시간대(분 대 일)에서 발생하기 때문에 P2XR 활성화 및 HIV-1 감염의 쌍을 이루는 분석을 허용하는 고처리량 방법이 부족합니다. 유동 세포측정과 같은 표준 고처리량 실험 기술은 인구 분석을 허용하지만 단일 세포에서 급성 및 세로 이벤트 사이의 관계를 평가할 수 없습니다. 대안적으로, 표준 형광 현미경 검사를 가진 단세포 화상 진찰은 낮은 처리량입니다. 이러한 실험적 한계는 급성 및 세로 세포 이벤트 사이의 연관성을 직접 측정하는 새로운 높은 처리량 기술의 필요성을 제시합니다.
설명된 광유체 시스템은 단일 세포 분류 및 격리, 배양, 이미징 및 소프트웨어 자동화16,17,18,19를할 수 있는 새로운 플랫폼이다. 이 시스템은 기존의 이미징 방법의 한계에 대한 통합된 높은 처리량 대안을 제시합니다. 비콘 플랫폼은 칩에 포함된 세포를 지원하는이산화탄소(CO2)및 온도 제어 인큐베이터로 구성됩니다. 칩에는 표적 광에 대응하여 전기 그라데이션을 생성하는 감광성 트랜지스터가 있습니다. 이 결과 이 생성 된 이전기 력은 나노 유체 칩을 가로 질러 개별 세포를 원하는 영역으로 이동하는 데 사용됩니다. 세포는 칩의 펜으로 정렬되어 개별 세포를 물리적으로 격리하는 장벽을 제공합니다. 칩 전체의 성장 매체의 연속 라미나르 흐름은 펜에서 세포 이동을 방지하면서 영양소와 실험별 시약의 작은 입자 확산을 허용합니다. 형광 현미경은 칩 위에 앉아 있다. 소프트웨어 자동화는 사용자가 지정한 시점에서 칩이미지를 캡처하는 데 사용됩니다.
모든 세포 특성화는 단세포 선택 및 조작을 위한 광유체 시스템을 사용하여 수행되었다. 이 시스템은 단일 세포 조작, 분석, 배양 및 이미징을 가능하게 하는 통합 기계, 미세 유체 및 광학 부품으로 구성됩니다. 세포는 3,500개의 개별 챔버(pens)로 구성된 일회용 나노유체 장치에 적재 및 배양되며, 각 장치는 하위 나노리터 부피를 보유할 수 있습니다. 세포는 빛 유도 된 디전기 전성 “케이지”를 사용하여 펜 내에서 배치될 수 있으며 온도 및 CO2-제어조건하에서 배양 될 수 있습니다. 미세 유체는 세포 배양 또는 약물 치료를 위한 칩에 미디어 또는 버퍼의 관류를 허용합니다. 작동 바늘은 배양 및 셔터 웰 플레이트에서 세포의 가져오기 및 수출을 허용합니다. 칩 영역은 세포 표현형 또는 기능적 분석을 특성화하기 위해 브라이트필드 및 형광 채널(DAPI, FITC, TRed 또는 Cy5 포함)에서 4배 또는 10배 배율로 배율할 수 있다. 전체 시스템은 미리 설계된 워크플로 또는 사용자 지정 실험에 사용할 수 있는 소프트웨어를 사용하여 자동화됩니다.
HIV-1 감염과 P2XR 사이의 관계는 연구되었지만 이러한 상호 작용을 병렬로 직접 특성화하는 높은 처리량 절차는 보고되지 않았습니다. 여기에서 저자는 단일 세포 수준에서 급성 칼슘 유입 및 후속 HIV-1 생산감염을 추적하여 HIV-P2XR 상호 작용을 연구하는 방법론을 설명합니다. 특히, 이것은 단일 셀에서 여러 표적의 직접적이고 높은 처리량, 세로 측정을 허용하는 새로운 도구를 설정합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단일 세포에서 칼슘 유입과 HIV-1 생산감염 사이의 관계를 연구하는 기술된 방법론은 다른 작용제 또는 관심있는 길항제에 대한 응답으로 세포내 칼슘 운동학을 연구하도록 적응할 수 있다. 이미징을 위한 세포 의 준비는 간단하고 최소한의 시간 집약적이며, 시약은 널리 사용되는 제조업체의 편리한 키트에서 사용할 수 있습니다. 플루오-4 기반 칼슘 측정은 문헌에 잘 설명되어 있으며, HIV-1은 이 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 벤자민 첸 박사와의 과학적 토론에 감사드립니다. 이 작품은 K08AI120806(THS), R01DA052255(THS 및 KB), R21AI152833(THS 및 KB)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
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