多パラメータ光流体プラットフォームを用いたカルシウム流入とHIV-1感染の単細胞特性
Summary
ここでは、単一の細胞が急性事象およびナノ流体装置上の生産的なHIV-1感染を監視するプロトコルを提示する。イメージングデータは、ウイルスと宿主の受容体相互作用とシグナル伝達経路のダイナミクスを定義します。これは、ナノ流体ハイスループット縦単細胞培養およびイメージングにおけるシグナリング動態と分子相互作用を研究する最初の方法です。
Abstract
HIV-1は、世界中で3700万人以上の人々に影響を与える慢性感染症を引き起こします。ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を持つ人々は、抗レトロウイルス療法にもかかわらず、慢性炎症に関連する併存疾患を経験する。しかしながら、これらの炎症シグナル伝達は十分に特徴付けられていない。細胞シグナル伝達事象および下流遺伝子発現の活性化に関する早期参入事象の役割は、単細胞レベルでは捉えられてはいません。ここでは、ライブ細胞蛍光顕微鏡の原理を、ユーザーがカスタマイズした時間コースを介して細胞を培養および画像化する自動単細胞プラットフォームに適用する方法について述べ、動的細胞プロセスのハイスループット分析を可能にする。このアッセイは、HIV-1感染直後の初期の事象、特にウイルスへの暴露に伴うカルシウムの流入、および蛍光レポーターウイルスを用いた生産的感染の発症の単細胞生蛍光顕微鏡を追跡することができる。MT-4細胞はカルシウム感受性染料を装填し、ナノ流体装置上の単離されたペンで培養される。培養細胞はHIV-1レポーターウイルス(HIV-1 NLCI)に感染している。ナノ流体装置の上に位置する蛍光顕微鏡は、急性HIV-1曝露後の8分の時間経過でカルシウムの流入を測定する。HIV-1生産的な感染は、4日間にわたって同じ細胞で測定される。これらの時間コースからの画像データを分析して、ウイルス宿主受容体相互作用およびシグナル伝達経路ダイナミクスを定義する。著者らは、単一細胞の選別、培養、イメージング、およびソフトウェア自動化が可能な新しい光流体プラットフォームを使用して、従来のイメージング法に代わる統合的でスケーラブルな代替手段を提示する。このアッセイは、パラメータの配列を測定しながら、細胞の種類、アゴニスト、またはアンタゴニスト効果を含む様々な条件下での事象の運動を測定することができます。これは、ナノ流体ハイスループット縦単細胞培養およびイメージングのための最初の確立された方法です:この技術は、細胞シグナル伝達動態と動的分子相互作用を研究するために広く適応することができます。
Introduction
慢性炎症は、HIV関連の早期罹患率および死亡率1、2、3の主要な原因である。HIVが炎症シグナルを活性化する複数のメカニズムがあり、最近の証拠は、カルシウム腺三リン酸(ATP)受容体であるHIVエントリにおけるP2X受容体の役割を示唆している3、4、5、6、7、8、9、10。P2Xサブタイプのプリナージック受容体(P2XR)は、この炎症の重要な促進役とすることができる。しかし、HIV-P2XR相互作用の分子メカニズムはほとんど知られておらず、HIV-1ウイルスの初期および後期のライフサイクルステップに影響を与える可能性があります。HIV関連慢性炎症を引き起こす経路と運動学を定義することは、HIV患者の治療オプションを進める上で極めて重要である。
HIV-1がP2X受容体を直接苦しめるかどうかを評価するには、P2XR活性化およびHIV-1感染を並行して測定する必要があります。P2XR活性とHIV-1感染のアッセイは独立して確立されています:細胞カルシウム流入はP2XR活性化の指標であり、HIV-1の生産的な感染はRNAの豊富さによって定量することができます。カルシウム流入の蛍光検出は、Fluo-4カルシウム感受性色素で可能であり、そして、HIV-1感染は、mCherry蛍光レポーターウイルスHIV-NLCI11、12、13、14、15で可視化することができる。
P2X活性化(急性細胞カルシウム流入)およびHIV-1感染(HIV-1 RNA合成)のこれらの指標は、異なるタイムスケール(分対日)に発生するため、P2XR活性化とHIV-1感染のペア分析を可能にする高スループットの方法が欠けている。フローサイトメトリーなどの標準的なハイスループット実験技術では、集団分析が可能ですが、単一細胞の急性事象と縦断事象の関係を評価することはできません。あるいは、標準的な蛍光顕微鏡による単細胞イメージングは、低スループットである。これらの実験的な制限は、急性細胞事象と縦断細胞事象との関連性を直接測定するための新しいハイスループット技術の必要性を示す。
記述される光流体システムは、単一細胞の選別および単一細胞の分離、培養、イメージング、およびソフトウェアオートメーション16、17、18、19を可能にする新しいプラットフォームである。このシステムは、従来のイメージング方法の制限に代わる、統合されたハイスループットの代替手段を提供します。ビーコンプラットフォームは、チップに含まれる細胞をサポートする二酸化炭素(CO2)と温度制御インキュベーターで構成されています。チップは、ターゲット光に応答して電気勾配を生成する感光トランジスタを有する。この結果得られる二電気泳動力は、個々の細胞をナノ流体チップを越えて所望の領域に移動させるために使用される。細胞はチップ上のペンに分類され、個々の細胞を物理的に分離する障壁を提供します。チップ全体の成長媒体の連続的な層流は、栄養素および実験特異的試薬の小粒子拡散を可能にしながら、ペンからの細胞の移動を防ぐ。蛍光顕微鏡はチップの上に座っています。ソフトウェアオートメーションは、ユーザー指定のタイムポイントでチップのイメージをキャプチャするために使用されます。
全ての細胞特性評価は、単一細胞選択および操作のための検体系を用いて行った。このシステムは、単一細胞操作、アッセイ、培養、イメージングを可能にする、機械的、マイクロ流体、光学的なコンポーネントの統合から成ります。細胞は、3,500個の個々のチャンバー(ペン)からなる使い捨てのナノ流体デバイス上にロードされ、培養され、それぞれがサブナノリットル体積を保持することができる。細胞は、光誘発性双電気泳動「ケージ」を使用してペン内に配置し、温度およびCO2制御条件下で培養することができる。マイクロ流体は細胞培養または薬物治療のためのチップ上の媒体または緩衝液の灌流を可能にする。作動した針は、インキュベートおよびシャッター付きウェルプレートからの細胞の輸出入を可能にする。チップ領域は、明視野および蛍光チャネル(DAPI、FITC、TRed、Cy5を含む)で4倍または10倍の倍率で画像化して、細胞のフェノタイプまたは機能解析を特徴付けることができます。システム全体は、設計済みのワークフローやカスタム実験に使用できるソフトウェアを使用して自動化されています。
HIV-1感染とP2XRの関係は検討されているが、これらの相互作用を並行して直接特徴付けるためのハイスループットの手順は報告されていない。ここでは、急性カルシウム流入とその後のHIV-1生産的感染を単細胞レベルで追跡することでHIV-P2XR相互作用を研究する方法論を説明する。特に、これは単一細胞内の複数のターゲットの直接的で高スループット、縦方向の測定を可能にする新しいツールを確立する。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一細胞におけるカルシウム流入とHIV-1生産的感染との関係を研究する記述された方法論は、他のアゴニストまたは関心のあるアンタゴニストに応答して細胞内カルシウム運動薬を研究するために適応することができる。イメージング用の細胞の調製は、簡単で、時間のかかる負担が最小限であり、試薬は広く使用されているメーカーの便利なキットで入手可能です。Fluo-4ベースのカルシウ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ベンジャミン・チェン博士との科学的な議論に感謝しています。この作品は、K08AI120806(THS)、R01DA052255(THSおよびKB)、R21AI152833(THSおよびKB)によって資金提供されました。
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
