Enkeltcellekarakterisering af calciumtilstrømning og HIV-1-infektion ved hjælp af en multiparameter optofluidisk platform
Summary
Her præsenterer vi en protokol, hvor enkelte celler overvåges for akutte hændelser og produktiv HIV-1-infektion på en nanofluidisk enhed. Billeddata definerer virusværtsreceptorinteraktioner og signalvejsdynamik. Dette er den første metode til nanofluidic high-throughput langsgående enkeltcellekultur og billeddannelse til at studere signalering af kinetik og molekylære interaktioner.
Abstract
HIV-1 forårsager en kronisk infektion, der påvirker mere end 37 millioner mennesker verden over. Mennesker, der lever med human immundefekt virus (HIV) oplever comorbiditet relateret til kronisk inflammation på trods af antiretroviral behandling. Disse inflammatoriske signalering er dog ikke fuldt karakteriseret. Den tidlige indgangsrolle ved aktivering af cellulære signalhændelser og downstream-genekspression er ikke blevet fanget på enkeltcelleniveau. Her beskriver forfatterne en metode, der anvender principper for live-celle fluorescensmikroskopi til en automatiseret enkeltcelleplatform, der kulturer og billeder celler over brugertilpassede tidskurser, hvilket giver mulighed for analyse af dynamiske cellulære processer med høj gennemløb. Denne analyse kan spore encellet levende fluorescensmikroskopi af tidlige hændelser, der umiddelbart følger hiv-1-infektion, især tilstrømningen af calcium, der ledsager eksponering for virussen og udvikling af produktiv infektion ved hjælp af en fluorescerende reportervirus. MT-4 celler er fyldt med et calciumfølsomt farvestof og dyrket i isolerede penne på en nanofluidisk enhed. De dyrkede celler er inficeret med en HIV-1 reporter virus (HIV-1 NLCI). Et fluorescensmikroskop placeret over den nanofluidiske enhed måler calciumtilstrømningen over et 8-minutters tidsforløb efter akut HIV-1-eksponering. HIV-1 produktiv infektion måles i de samme celler over en 4-dages interval. Billeddata fra disse tidskurser analyseres for at definere virus-host receptor interaktioner og signaleringsvej dynamik. Forfatterne præsenterer et integreret, skalerbart alternativ til traditionelle billeddannelsesmetoder ved hjælp af en ny optofluidic platform, der er i stand til enkeltcellesortering, dyrkning, billeddannelse og softwareautomatisering. Denne analyse kan måle kinetik af begivenheder under forskellige forhold, herunder celletype, agonist eller antagonistisk effekt, mens du måler en række parametre. Dette er den første etablerede metode til nanofluidic high-throughput langsgående enkeltcellekultur og billeddannelse: Denne teknik kan tilpasses bredt til at studere cellulære signalering kinetik og dynamiske molekylære interaktioner.
Introduction
Kronisk inflammation er en førende årsag til HIV-associerede tidlige sygelighed ogdødelighed 1,2,3. Der er flere mekanismer, hvor hiv kan aktivere inflammatorisk signalering, og de seneste beviser tyder på en rolle for P2X receptorer i HIV indrejse, som er calcium-gating adenosin triphosphat (ATP) receptorer3,4,5,6,7,8,9,10. P2X-undertypen af purinergiske receptorer (P2XR) kan være vigtige facilitatorer af denne betændelse. Men de molekylære mekanismer i HIV-P2XR interaktioner er stort set ukendt og kan påvirke tidligt og sent HIV-1 viral livscyklus trin. Definition af veje og kinetik kørsel HIV-associeret kronisk inflammation er afgørende for at fremme behandlingsmuligheder for mennesker med HIV.
For at vurdere, om HIV-1 direkte agonizes P2X receptorer, P2XR aktivering og HIV-1 infektion skal måles parallelt. Assays af P2XR aktivitet og HIV-1 infektion er blevet uafhængigt etableret: Cellular calcium tilstrømning er en indikator for P2XR aktivering, og HIV-1 produktiv infektion kan kvantificeres ved RNA overflod. Fluorescens påvisning af calcium tilstrømning er muligt med Fluo-4 calcium-følsomme farvestof, og HIV-1 infektion kan visualiseres med mCherry fluorescerende reporter virus HIV-NLCI11,12,13,14,15.
Da disse indikatorer for P2X-aktivering (akut cellulær calciumtilstrømning) og HIV-1-infektion (HIV-1 RNA-syntese) forekommer på forskellige tidshorisonter (minutter versus dage), mangler der en høj overførselsmetode, der giver mulighed for parret analyse af P2XR-aktivering og HIV-1-infektion. Eksperimentelle teknikker med høj gennemløb, såsom flowcytometri, giver mulighed for befolkningsanalysen, men kan ikke vurdere forholdet mellem akutte og langsgående hændelser i enkelte celler. Alternativt er enkeltcellebilleddannelse med standard fluorescensmikroskopi lav gennemløb. Disse eksperimentelle begrænsninger udgør et behov for nye, høj-throughput teknikker til at måle sammenhænge mellem akutte og langsgående cellulære begivenheder direkte.
Et optofluidisk system, der beskrives, er en ny platform, der er i stand til enkeltcellesortering og isolation, dyrkning, billedbehandling og softwareautomatisering16,17,18,19. Dette system præsenterer et integreret, højgennemstrømningsalternativ til begrænsningerne i traditionelle billeddannelsesmetoder. Beacon-platformen består af en kuldioxid (CO2)og temperaturstyret inkubator, der understøtter celler indeholdt på en chip. Chippen har lysfølsomme transistorer, der genererer en elektrisk gradient som reaktion på målrettet lys. Denne resulterende dilektrophoretiske kraft bruges til at flytte individuelle celler over den nanofluidiske chip til de ønskede regioner. Celler sorteres i kuglepenne på chippen, hvilket giver en barriere for at isolere individuelle celler fysisk. Kontinuerlig laminar strøm af vækstmedier i hele chippen forhindrer celle migration fra penne og samtidig give mulighed for små-partikel diffusion af næringsstoffer og eksperiment-specifikke reagenser. Et fluorescensmikroskop sidder over chippen. Softwareautomatisering bruges til at tage billeder af chippen på det brugerdefinerede tidspunkt.
Al cellekarakterisering blev udført ved hjælp af et optofluidisk system til markering og manipulation af en enkelt celle. Dette system består af integrerede mekaniske, mikrofluidiske og optiske komponenter, der muliggør enkeltcellemanipulation, analyse, kultur og billeddannelse. Cellerne lastes og dyrkes på den engangs nanofluidiske enhed bestående af 3.500 individuelle kamre (kuglepenne), der hver især er i stand til at holde sub-nanolitervolumen. Celler kan placeres i kuglepenne ved hjælp af lysinducerede dielektrotrophoretiske “bure” og dyrkes under temperatur- og CO2-kontrolleredeforhold. Mikrofluidics tillader perfusion af medier eller buffere på chippen til cellekultur eller lægemiddelbehandling. En aktiveret nål giver mulighed for import og eksport af celler fra inkuberede og lukkede brøndplader. Chipområdet kan afbildes ved 4x eller 10x forstørrelse i brightfield- og fluorescerende kanaler (herunder DAPI, FITC, TRed eller Cy5) for at karakterisere cellulære fænotyper eller funktionel analyse. Hele systemet automatiseres ved hjælp af software, der kan bruges til foruddefinerede arbejdsgange eller brugerdefinerede eksperimenter.
Forholdet mellem HIV-1-infektion og P2XR er blevet undersøgt, men der er ikke rapporteret om en højoverførselsprocedure, der direkte karakteriserer disse interaktioner parallelt. Her beskriver forfatterne en metode til at studere HIV-P2XR-interaktioner gennem sporing af akut calciumtilstrømning og efterfølgende HIV-1-produktiv infektion på enkeltcelleniveau. Dette etablerer især et nyt værktøj, der giver mulighed for direkte, høj gennemstrømning, langsgående måling af flere mål i enkelte celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den beskrevne metode til at undersøge forholdet mellem calcium tilstrømning og HIV-1 produktiv infektion i enkeltceller kan tilpasses til at studere intracellulære calcium kinetik som reaktion på andre agonister eller antagonister af interesse. Forberedelsen af celler til billeddannelse er enkel, minimalt tidskrævende, og reagenser fås i praktiske kits fra udbredte producenter. Fluo-4-baseret calciummåling er godt beskrevet i litteraturen, og HIV-1 kan let erstatte andre vira eller forbindelser af interesse for at…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi er taknemmelige for de videnskabelige drøftelser med Dr. Benjamin Chen. Dette arbejde blev finansieret af K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS og KB) og R21AI152833 (THS og KB).
Materials
| Beacon Optofluidic System | Berkeley Lights | ||
| Fetal Bovine Serum | Gibco | ||
| FIJI | Open-source software | PMID: 22743772, 22930834 | |
| Fluo-4 Calcium Imaging Kit | Thermo Fisher | F10489 | |
| HIV-1 NLCINL4-3 | Laboratory of Benjamin Chen | PMID: 28148796 | |
| Hyclone Pennecillin Streptomycin solution | GE Healthcare Life sciences | SV30010 | |
| MT-4 cells | NIH AIDS Reagent | ARP-120 | |
| OptoSelect 3500 chip | Berkeley Lights | ||
| Pipettor Tips | Denville Scientific | P3020-CPS | |
| Prism 9.0.0 | GraphPad | ||
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | |
| Serological Pipettes | Fisher Brand | 13-678-11E | |
| Tissue Culture Hood | Various models | ||
| T75 flasks | Corning | 3073 | |
References
- Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
- Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
- Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585 (2015).
- Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
- Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
- Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
- Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186 (2019).
- Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
- Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
- Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
- Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
- Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
- Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
- He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
- Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425 (2017).
- Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010 (2018).
- Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247 (2020).
- Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41 (2018).
- Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
- Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692 (2019).
- Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074 (2018).
- Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622 (2020).
