زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة
Summary
يظهر هنا بروتوكول لزرع نافذة جمجمة مزمنة للتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس.
Abstract
لفهم الفسيولوجيا الخلوية للخلايا العصبية والدبقية في الحيوانات التي تتصرف بشكل كامل ، من الضروري تصور مورفولوجيتها وتسجيل نشاطها في الجسم الحي في الفئران التصرف. تصف هذه الورقة طريقة لزرع نافذة جمجمة مزمنة للسماح بالتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس. بالاقتران مع الاستراتيجيات الجينية والحقن الفيروسية ، من الممكن تسمية خلايا ومناطق محددة ذات أهمية بعلامات هيكلية أو فسيولوجية. يوضح هذا البروتوكول كيفية الجمع بين الحقن الفيروسية لتسمية الخلايا العصبية بالقرب من الخلايا النجمية المعبرة عن GCaMP6 في القشرة للتصوير المتزامن لكلتا الخليتين من خلال نافذة الجمجمة. يمكن إجراء التصوير متعدد الفوتونات لنفس الخلايا لأيام أو أسابيع أو أشهر في الحيوانات المستيقظة التي تتصرف. يوفر هذا النهج للباحثين طريقة لعرض الديناميكيات الخلوية في الوقت الفعلي ويمكن تطبيقها للإجابة على عدد من الأسئلة في علم الأعصاب.
Introduction
تعد القدرة على إجراء الفحص المجهري الفلوري متعدد الفوتونات في الجسم الحي في قشرة الفئران أمرا بالغ الأهمية لدراسة الإشارات الخلوية والبنية1،2،3،4،5،6،7،8،9 ، وأمراض الأمراض10،11 ، والتطور الخلوي12،13 . مع زرع نوافذ الجمجمة المزمنة ، يكون التصوير الطولي ممكنا ، مما يسمح بالتصوير المتكرر للمناطق القشرية لأيام أو أسابيع أو أشهر13,14 في الحيوانات الحية. يعد الفحص المجهري متعدد الفوتونات مثاليا للتصوير المتكرر في الجسم الحي بسبب تحسين فحص العمق وتقليل الضرر الضوئي المرتبط بليزر الأشعة تحت الحمراء المستخدم. هذا يسمح لدراسة الديناميكيات الجزيئية والخلوية لخلايا معينة في مختلف المناطق القشرية .
تم استخدام المجهر متعدد الفوتونات في التصوير الحي للخلايا العصبية والدبقية في الفئران 15،16،17،18،19،20. يمكن تنفيذ استراتيجيات مختلفة لتسمية أنواع معينة من الخلايا ومجالات الاهتمام. أحد الأساليب الشائعة هو دفع التعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة وراثيا بطريقة خاصة بالخلية باستخدام نظام إعادة تركيب Cre-Lox. يمكن إجراء ذلك مع الفئران المعدلة وراثيا ، على سبيل المثال ، عبور الفأر tdTomato “floxed” (Ai14) مع فأر يعبر عن Cre-recombinase تحت مروج مثير للاهتمام21. بدلا من ذلك ، يمكن تحقيق وضع العلامات الخاصة بالخلايا والموقع باستخدام الحقن الفيروسية. هنا ، يتم حقن فيروس يشفر Cre recombinase تحت محرك خاص بالخلية وفيروس يشفر جينا مفلطخا ذا أهمية في منطقة محددة. ثم تعبر أنواع الخلايا المناسبة التي تتلقى كلا الناقلين الفيروسيين عن الجين (الجينات) المطلوب. يمكن أن تكون هذه الجينات علامات هيكلية ، مثل tdTomato، لعرض التغيرات في التشكل الخلوي22 أو مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) ، مثل GCaMP و / أو RCaMP ، لفحص ديناميكيات الكالسيوم23. يمكن تطبيق طرق إعادة التركيب الجيني بشكل فردي أو مجتمعة لتسمية نوع واحد أو أكثر من الخلايا. وهناك نهج ثالث ، لا يتطلب الفئران المعدلة وراثيا أو التركيبات الفيروسية (التي لديها قدرة تعبئة محدودة) ، هو في الرحم الكهربائي من بنى الحمض النووي24. اعتمادا على توقيت الكهربية ، يمكن استهداف أنواع مختلفة من الخلايا 25،26،27.
عند إجراء التصوير متعدد الفوتونات ، يمكن تصوير الفئران أثناء الاستيقاظ أو التخدير. يمكن إجراء تصوير الفئران المستيقظة عن طريق تأمين الماوس عبر لوحة رأس متصلة28. يتم جعل هذا النهج أقل إرهاقا من خلال السماح بحرية الحركة نسبيا للحيوان باستخدام طرق ، مثل كرات الستايروفوم29 العائمة بحرية ، أو أجهزة المشي العائمة بحرية1 ، أو نظام القفص المنزلي الذي يتم رفعه بالهواء حيث يتم تثبيت الفئران بواسطة لوحة رأس متصلة ويسمح لها بالتحرك في غرفة مفتوحة30. لكل من ظروف التصوير هذه ، سيكون من الضروري أولا تعويد الفئران على إعداد التصوير. تصف هذه الورقة إجراء التعود والتصوير باستخدام نظام قفص منزلي يتم رفعه جوا.
يصف هذا البروتوكول زرع نافذة قحفية مزمنة للتصوير الطولي في الجسم الحي في القشرة. هنا ، سنستخدم الفئران التي تعبر بشكل مشروط عن GCaMP6f في الخلايا النجمية لمراقبة ديناميكيات إشارات الكالسيوم. علاوة على ذلك ، تصف هذه الورقة إجراء الحقن الفيروسية باستخدام tdTomato كتسمية للخلايا العصبية. هذا يسمح بتحديد التغيرات في البنية المشبكية العصبية و / أو التوافر كعلامة هيكلية تمكن من التصوير المتكرر لنفس الخلايا النجمية. وخلال البروتوكول، سيتم تسليط الضوء على الخطوات الحاسمة لضمان أفضل جودة ممكنة للصور التي يتم الحصول عليها من الفحص المجهري متعدد الفوتونات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، قدمنا بروتوكولا لزرع نوافذ الجمجمة المزمنة للتصوير في الجسم الحي للخلايا النجمية القشرية والخلايا العصبية في الفئران المستيقظة والمقيدة الرأس على قفص منزلي يتم رفعه جوا. تم تقديم أمثلة محددة لتطبيق نافذة الجمجمة لتصوير الخلايا النجمية التي تعبر عن GECIs والهياكل العصبية المتشا?…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
- Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
- Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
- Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
- Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
- Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
- Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
- Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
- Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
- Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742 (2014).
- Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
- Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
- Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
- Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
- Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
- Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
- Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
- Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024 (2011).
- Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
- Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
- Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
- Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869 (2014).
- Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
- De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
- Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
- Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
- Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742 (2012).
- Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium–implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
- Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
- Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464 (2018).
- Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
- Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
- Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer’s disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422 (2014).
