जागते चूहों में वीवो इमेजिंग में दोहराया के लिए एक कपाल खिड़की का आरोपण
Summary
यहां प्रस्तुत किया गया है जागते हुए, सिर-संयमित चूहों में मस्तिष्क कोशिकाओं के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की के आरोपण के लिए एक प्रोटोकॉल है।
Abstract
जानवरों के व्यवहार में न्यूरॉन्स और ग्लिया के सेलुलर फिजियोलॉजी को पूरी तरह से समझने के लिए, उनकी आकृति विज्ञान की कल्पना करना और चूहों के व्यवहार में विवो में उनकी गतिविधि को रिकॉर्ड करना आवश्यक है। यह पेपर जागने, सिर-संयमित चूहों में मस्तिष्क कोशिकाओं के अनुदैर्ध्य इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की के आरोपण के लिए एक विधि का वर्णन करता है। आनुवांशिक रणनीतियों और वायरल इंजेक्शन के साथ संयोजन में, संरचनात्मक या शारीरिक मार्करों के साथ विशिष्ट कोशिकाओं और रुचि के क्षेत्रों को लेबल करना संभव है। यह प्रोटोकॉल दर्शाता है कि एक कपाल खिड़की के माध्यम से दोनों कोशिकाओं की एक साथ इमेजिंग के लिए कॉर्टेक्स में GCaMP6-व्यक्त एस्ट्रोसाइट्स के आसपास के क्षेत्र में न्यूरॉन्स को लेबल करने के लिए वायरल इंजेक्शन को कैसे संयोजित किया जाए। एक ही कोशिकाओं की मल्टीफोटॉन इमेजिंग को जागने, जानवरों के व्यवहार में दिनों, हफ्तों या महीनों के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को वास्तविक समय में सेलुलर गतिशीलता को देखने के लिए एक विधि प्रदान करता है और तंत्रिका विज्ञान में कई सवालों के जवाब देने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
चूहों के प्रांतस्था में विवो मल्टीफोटॉन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में प्रदर्शन करने की क्षमता सेलुलर सिग्नलिंग और संरचना 1,2,3,4,5,6,7,8,9, रोग विकृति 10,11, और सेलुलर विकास 12,13 के अध्ययन के लिए सर्वोपरि है . क्रोनिक कपाल खिड़कियों के आरोपण के साथ, अनुदैर्ध्य इमेजिंग संभव है, जो जीवित जानवरों में दिनों, हफ्तों या महीनोंके लिए कॉर्टिकल क्षेत्रों की बार-बार इमेजिंग की अनुमति देता है। मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी विवो में के लिए आदर्श है, बेहतर गहराई की जांच के कारण बार-बार इमेजिंग और उपयोग किए जाने वाले अवरक्त लेजर से जुड़े कम फोटोडैमेज। यह विभिन्न कॉर्टिकल क्षेत्रों में विशिष्ट कोशिकाओं के आणविक और सेलुलर गतिशीलता के अध्ययन की अनुमति देता है।
मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग चूहों में न्यूरोनल और ग्लियाल कोशिकाओं के विवो इमेजिंग में15,16,17,18,19,20 के लिए किया गया है। विशेष सेल प्रकारों और रुचि के क्षेत्रों को लेबल करने के लिए विभिन्न रणनीतियों को लागू किया जा सकता है। एक आम दृष्टिकोण क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन प्रणाली का उपयोग करके एक सेल-विशिष्ट तरीके से आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति को चलाना है। यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों के साथ किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, tdTomato “floxed” माउस (Ai14) को पार करना एक माउस के साथ ब्याज21 के प्रमोटर के तहत क्रे-रिकॉम्बिनेज को व्यक्त करता है। वैकल्पिक रूप से, सेल- और साइट-विशिष्ट लेबलिंग को वायरल इंजेक्शन के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यहां, एक वायरस एन्कोडिंग क्रे रीकॉम्बिनेज एक सेल-विशिष्ट प्रोमोटर के तहत और एक वायरस एन्कोडिंग ब्याज के एक floxed जीन को एक परिभाषित क्षेत्र में इंजेक्ट किया जाता है। दोनों वायरल वैक्टर प्राप्त करने वाले उपयुक्त सेल प्रकार तब वांछित जीन (ओं) को व्यक्त करेंगे। ये जीन संरचनात्मक मार्कर हो सकते हैं, जैसे कि टीडीटोमेटो, सेलुलर आकृति विज्ञान22 या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों (जीईसीआई) में परिवर्तन को देखने के लिए, जैसे कि जीसीएएमपी और / या आरसीएएमपी, कैल्शियम गतिशीलता23 की जांच करने के लिए। आनुवांशिक पुनर्संयोजन के तरीकों को व्यक्तिगत रूप से या एक या अधिक सेल प्रकारों को लेबल करने के लिए संयोजन में लागू किया जा सकता है। एक तीसरा दृष्टिकोण, ट्रांसजेनिक चूहों या वायरल निर्माणों (जिसमें सीमित पैकेजिंग क्षमता है) की आवश्यकता नहीं है, डीएनए निर्माणों के गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरेशन में है। इलेक्ट्रोपोरेशन के समय के आधार पर, विभिन्न सेलप्रकारों को 25,26,27 लक्षित किया जा सकता है।
मल्टीफोटॉन इमेजिंग करते समय, चूहों को जागते समय या एनेस्थेटिक करते समय चित्रित किया जा सकता है। जागृत चूहों की इमेजिंग एक संलग्न सिर प्लेट28 के माध्यम से माउस को सुरक्षित करके की जा सकती है। इस दृष्टिकोण को तरीकों का उपयोग करके जानवर के अपेक्षाकृत मुक्त आंदोलन की अनुमति देकर कम तनावपूर्ण बनाया जाता है, जैसे कि फ्री-फ्लोटिंग, एयर-समर्थित स्टायरोफोम बॉल्स29, फ्री-फ्लोटिंगट्रेडमिल्स 1, या एक एयर-लिफ्टेड होम केज सिस्टम जहां चूहों को एक संलग्न हेड प्लेट द्वारा बांधा जाता है और एक खुले कक्ष30 में स्थानांतरित करने की अनुमति दी जाती है। इन इमेजिंग स्थितियों में से प्रत्येक के लिए, पहले इमेजिंग सेटअप के लिए चूहों को आदत डालना आवश्यक होगा। यह पेपर हवा से उठाए गए घर के पिंजरे की प्रणाली का उपयोग करके आदत और इमेजिंग प्रक्रिया का वर्णन करता है।
यह प्रोटोकॉल कॉर्टेक्स में विवो इमेजिंग में अनुदैर्ध्य के लिए एक पुरानी कपाल खिड़की के आरोपण का वर्णन करता है। यहां, हम चूहों का उपयोग करेंगे जो कैल्शियम सिग्नलिंग गतिशीलता की निगरानी करने के लिए एस्ट्रोसाइट्स में GCaMP6f को सशर्त रूप से व्यक्त करते हैं। इसके अलावा, यह पेपर न्यूरॉन्स के लिए एक लेबल के रूप में टीडीटोमेटो का उपयोग करके वायरल इंजेक्शन के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। यह न्यूरोनल सिनैप्टिक संरचना में परिवर्तन और / या एक संरचनात्मक मार्कर के रूप में उपलब्धता के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक ही एस्ट्रोसाइट की बार-बार इमेजिंग को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल के दौरान, मल्टीफोटॉन माइक्रोस्कोपी से प्राप्त छवियों की सर्वोत्तम संभव गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों पर प्रकाश डाला जाएगा।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां, हमने क्रोनिक कपाल खिड़कियों के आरोपण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, जो जागने में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के विवो इमेजिंग में, हवा से उठाए गए घर के पिंजरे पर सिर-संयमित चूहो?…
Materials
| 15o Pointed Blade | Surgistar | 6500 | Surgery Tools |
| 19 G Needles | BD | 305186 | Surgery Supply |
| AAV1-CAG-FLEX-tdTomato | Addgene | 28306-AAV1 | Viral Vector |
| AAV1-CaMKII-0-4-Cre | Addgene | 105558-AAV1 | Viral Vector |
| Acteone | Fisher Scientific | A16P4 | Reagent |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | Covidien 5750 | Surgery Supply |
| Beveler | Narishige | Equipment | |
| Borosilicate Glass | World Precision Instruments | TW100F-4 | Surgery Supply |
| Carbide Burs | SS White Dental | 14717 | Surgery Tools |
| Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL | Zoetis Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Compressed Air | Fisher Scientific | 23-022-523 | Surgery Supply |
| Cotton Tip Applicators | Puritan | 836-WC NO BINDER | Surgery Supply |
| Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm | Warner Instruments | 64-0720, 64-0700 | Surgery Supply |
| Dental Drill | Aseptico | Equipment | |
| Dexamethasone, 4 mg/mL | Mylan Institutional, LLC. | Drug | |
| Dissecting Microscope | Nikon | Equipment | |
| Duralay Liquid (dental cement liquid) | Patterson Dental | 602-8518 | Reagent |
| Duralay Powder (dental cement powder) | Patterson Dental | 602-7932 | Reagent |
| Enrofloxacin, 2.27% | Bayer | Drug | |
| Eye Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Surgery Supply |
| Fiber Lite High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries | Equipment | |
| Forceps (Large) | World Precision Instruments | 14099 | Surgery Tools |
| Forceps (Small) | World Precision Instruments | 501764 | Surgery Tools |
| GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 024105 | Mouse line |
| Germinator | Fisher Scientific | Equipment | |
| GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J | The Jackson Laboratory | Stock No: 012586 | Mouse Line |
| Headplate | Neurotar | Model 1, Model 3 | Surgery Supply |
| Hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501705 | Surgery Tools |
| Holder for 15o Pointed Blade | World Precision Instruments | 501247 | Surgery Tools |
| Holder for Scalpel Blades | World Precision Instruments | 500236 | Surgery Tools |
| Iodine Prep Pads | Avantor | 15648-926 | Surgery Supply |
| Isoflurane | Piramal | Surgery Supply | |
| Isoflurane table top system with Induction Box | Harvard Apparatus | Equipment | |
| Isoflurane Vaporizer | SurgiVet | Equipment | |
| Krazy Glue | Office Depot | KG517 | Reagent |
| Loctite 401 | Henkel | 40140 | fast-curing instant adhesive |
| Loctite 454 | Fisher Scientific | NC9194415 | cyanoacrylate adhesive gel |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | Equipment | |
| Multiphoton Microscope | Equipment | ||
| Nitrogen | Matheson | NI M200 | Gas |
| Oxygen | Matheson | OX M250 | Gas |
| Picospritzer | Parker | intracellular microinjection dispense system | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014340 | Surgery Supply |
| Rodent Hair Trimmer | Wahl | Equipment | |
| Saline (0.9% Sodium Chloride) | Med Vet International | RX0.9NACL-30BAC | Surgery Supply |
| Scalpel Blades, Size 11 | Integra | 4-111 | Surgery Tools |
| Scissors | World Precision Instruments | 503667 | Surgery Tools |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | Equipment | |
| Sugi Sponge Strips (sponge strips) | Kettenbach Dental | 31002 | Surgery Supply |
| SURGIFOAM (gel foam) | Ethicon | 1972 | Surgery Supply |
| Syringe with 26 G Needle | BD | 309625 | Surgery Supply |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648-1G | Reagent |
| Ti:Sapphire Laser | Coherent | Equipment | |
| Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Surgery Supply |
| Water Blanket | Fisher Scientific | Equipment | |
| Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL | Fresenius Kabi USA | Drug |
References
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