Främre segment organkulturplattform för spårning av Open Globe-skador och terapeutisk prestanda
Summary
Ögonskador i öppen jordglob kan gå obehandlade i flera dagar i landsbygds- eller militärrelevanta scenarier, vilket resulterar i blindhet. Terapier behövs för att minimera synförlust. Här beskriver vi en organkultur open globe skademodell. Med denna modell kan potentiella terapier för stabilisering av dessa skador utvärderas ordentligt.
Abstract
Öppna globen skador har dåliga visuella resultat, ofta resulterar i permanent förlust av vision. Detta beror delvis på en förlängd försening mellan skador och medicinska insatser i landsbygdsmiljöer och militära medicinapplikationer där oftalmisk vård inte är lätt tillgänglig. Obehandlade skador är mottagliga för infektion efter att ögat har förlorat sin vattentäta tätning, liksom förlust av vävnadens livskraft på grund av intraokulär hypotoni. Terapier för att tillfälligt försegla öppna globe skador, om korrekt utvecklats, kan återställa intraokulärt tryck och förhindra infektion tills korrekt oftalmisk vård är möjlig. För att underlätta produktutveckling, detaljerad här är användningen av en främre segment organkultur öppen jordglob skada plattform för att spåra terapeutiska prestanda för minst 72 h efter skada. Svin främre segment vävnad kan upprätthållas i specialdesignade organ kultur rätter och hålls vid fysiologiskt intraokulärt tryck. Punkteringsskador kan skapas med ett pneumatiskt system som kan generera skadestorlekar upp till 4,5 mm i diameter, liknande militärrelevanta skadestorlekar. Förlust av intraokulärt tryck kan observeras för 72 h efter skada bekräftar korrekt skada induktion och förlust av ögats vattentäta tätning. Terapeutiska prestanda kan spåras genom applicering på ögat efter skada induktion och sedan spåra intraokulärt tryck i flera dagar. Vidare är den främre segmentets skademodell tillämplig på allmänt använda metoder för funktionell och biologisk spårning av fysiologi inom det främre segmentet, såsom bedömning av transparens, okulär mekanik, hornhinnans epitelhälsa och vävnadsaktivitet. Sammantaget är metoden som beskrivs här ett nödvändigt nästa steg mot att utveckla biomaterialterapier för att tillfälligt försegla öppna jordglobskador när oftalmisk vård inte är lätt tillgänglig.
Introduction
Öppna jordglobsskador (OG) kan leda till permanent synförlust när de inte behandlas eller åtminstone stabiliseras efter skada1. Förseningar är dock vanliga i avlägsna områden där det inte är lätt att få tillgång till oftalmiska ingripanden, till exempel på landsbygden eller på slagfältet i militära scenarier. När behandlingen inte är lättillgänglig är den nuvarande vårdstandarden att skydda ögat med en styv sköld tills medicinsk intervention är möjlig. Inom militärmedicinen är denna försening för närvarande upp till 24 timmar, men den förväntas öka upp till 72 h i framtida stridsoperationer i stadsmiljöer där luftevakuering inte ärmöjlig 2,3,4. Dessa förseningar kan vara ännu längre i lantliga, avlägsna civila applikationer där tillgången till oftalmisk intervention är begränsad5,6. En obehandlad OG-skada är mycket mottaglig för infektion och förlust av intraokulärt tryck (IOP) på grund av att den vattentäta tätningen i ögat äventyras7,8. Förlust av IOP kan påverka vävnadens livskraft, vilket gör det osannolikt att någon medicinsk intervention återställer synen om förseningen mellan skada och terapeutisk är för lång9.
För att möjliggöra utveckling av lättanvända terapier för tätning av OG-skador tills en oftalmisk specialist kan nås, utvecklades en bänktop OG-skademodelltidigare 10,11. Med denna modell skapades höghastighetsskador i hela svinögon medan IOP fångades av tryckgivare. Therapeutics kan sedan appliceras för att bedöma deras förmåga att försegla OG skada plats12. Men eftersom denna modell använder hela svin ögon, Det kan bara bedöma omedelbar terapeutisk prestanda utan möjlighet att spåra långsiktiga prestanda över det möjliga 72 h fönstret där den terapeutiska måste stabilisera skadestället tills patienten når specialvård. Som ett resultat utvecklades en främre segment organ kultur (ASOC) OG skada modell och beskrivs i detta protokoll som en plattform för att spåra långsiktiga terapeutiska prestanda13.
ASOC är en allmänt använd teknik för att upprätthålla avaskulär vävnad i det främre segmentet, såsom hornhinnan, i flera veckor efter enucleation14,15,16,17. Det främre segmentet upprätthålls under fysiologisk IOP genom att perfusera vätska vid fysiologiskaflödeshastigheteroch bevara den trabekulära meshwork utflödesregionen, vävnaden som ansvarar för att reglera IOP, under ASOC-inställning 18,19. ASOC-plattformen kan upprätthålla vävnad fysiologiskt, inducera en OG-skada med hjälp av en pneumatisk driven enhet, tillämpa en terapeutisk och spårskadastabilisering i minst 72 h efter skada13.
Här ger protokollet en steg-för-steg-metodik för att använda ASOC-plattformen. Först beskriver den hur man ställer in och tillverkar ASOC-plattformen. Därefter beskriver protokollet hur man aseptiskt dissekerar det främre segmentet och upprätthåller trabekulär meshwork, följt av att ställa in främre segmentvävnad i specialbyggda organkulturrätter. Sedan beskriver det hur man skapar öppna globe-skador och applicerar terapeutiska omedelbart efter skada. Slutligen ger protokollet en översikt över karakteriseringsparametrar som är möjliga att använda med denna metod som bedömer funktionella, mekaniska och biologiska egenskaper hos ögat och hur väl skadan stabiliserades. Sammantaget ger denna modell en välbehövlig plattform för att påskynda produktutvecklingen för att stabilisera och behandla öppna jordglobskador och förbättra prognosen för dålig syn efter skada.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns kritiska steg med ASOC OG skadeplattform som bör lyftas fram för att förbättra sannolikheten för framgång när du använder metoden. För det första, under den främre segment dissekeringen, är bevarandet av trabekulär meshwork viktigt men utmanande att göra korrekt. Om TM störs kommer ögat inte att upprätthålla fysiologiskt tryck och uppfyller inte behörighetskriterierna för experimentell användning. Det rekommenderas att öva dissekeringsprocessen under normala förhållanden först snarare ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta material är baserat på arbete som stöds av USA: s försvarsdepartement genom ett interagency-avtal (#19-1006-IM) med det tillfälliga förvärvsprogrammet för cornealreparation (United States Army Medical Materiel Development Agency).
Materials
| 10-32 Polycarbonate straight plug, male threaded pipe connector | McMaster-Carr | 51525K431 | |
| 10-32 Socket cap screw, ½" | McMaster-Carr | 92196A269 | |
| 10 mL syringe | BD | 302995 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| Anti-Anti | Gibco | 15240-096 | |
| Ball-End L key | McMaster-Carr | 5020A25 | |
| Betadine | Fisher Scientific | NC1696484 | |
| BD Intramedic PE 160 Tubing | Fisher Scientific | 14-170-12E | |
| Cotton swabs | Puritan | 25-8061WC | |
| DMEM media | ATCC | 30-2002 | |
| FBS | ATCC | 30-2020 | |
| Fine forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Gauze | Covidien | 8044 | |
| Gentamicin | Gibco | 15710-064 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| High temperature silicone O-ring, 2 mm wide, 4 mm ID | McMaster-Carr | 5233T47 | |
| Large forceps | World Precision Instruments | 500365 | |
| Large surgical scissors | World Precision Instruments | 503261 | |
| Medium toothed forceps | World Precision Instruments | 501217 | |
| Nail (puncture object) | McMaster-Carr | 97808A503 | |
| Nylon syringe filters | Fisher | 09-719C | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Petri dish (100 mm) | Fisher | FB0875713 | |
| Polycarbonate, three-way, stopcock with male luer lock | Fisher | NC9593742 | |
| Razor blade | Fisher | 12-640 | |
| Stainless steel 18 G 90 degree angle dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A81 | |
| Stainless steel 18 G straight ½'’ dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A675 | |
| Sterile 100 mL beakers with lids | VWR | 15704-092 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | WP5070 |
References
- Hilber, D., Mitchener, T. A., Stout, J., Hatch, B., Canham-Chervak, M. Eye injury surveillance in the US Department of Defense, 1996-2005. American Journal of Preventive Medicine. 38, 78-85 (2010).
- Linde, A. S., McGinnis, L. J., Thompson, D. M. Multi-Battle domain-perspective in military medical simulation trauma training. Journal of Trauma & Treatment. 06 (04), (2017).
- Riesberg, J., Powell, D., Loos, P. The loss of the golden hour. Special Warfare. , 49-51 (2017).
- Townsend, S., Lasher, W. . The US Army in Multi-Domain Operations 2028. (525-3-1), (2018).
- Blanch, R. J., Bishop, J., Javidi, H., Murray, P. I. Effect of time to primary repair on final visual outcome after open globe injury. The British Journal of Ophthalmology. 103 (10), 1491-1494 (2019).
- Lesniak, S. P., et al. Characteristics and outcomes of delayed open globe repair. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (14), 4954 (2012).
- Loporchio, D., Mukkamala, L., Gorukanti, K., Zarbin, M., Langer, P., Bhagat, N. Intraocular foreign bodies: A review. Survey of Ophthalmology. 61 (5), 582-596 (2016).
- Jonas, J. B., Budde, W. M. Early versus late removal of retained intraocular foreign bodies. Retina. 19 (3), 193-197 (1999).
- Watson, P. G., Jovanovik-Pandova, L. Prolonged ocular hypotension: would ciliary tissue transplantation help. Eye. 23 (10), 1916-1925 (2009).
- Snider, E. J., et al. Development and characterization of a benchtop corneal puncture injury model. Scientific Reports. 10 (1), 4218 (2020).
- Snider, E. J., et al. An open-globe porcine injury platform for assessing therapeutics and characterizing biological effects. Current Protocols in Toxicology. 86 (1), 98 (2020).
- Snider, E. J., Cornell, L. E., Gross, B., Zamora, D. O., Boice, E. N. Assessment of commercial off-the-shelf tissue adhesives for sealing military relevant corneal perforation injuries. Military Medicine. , (2021).
- Snider, E. J., Boice, E. N., Butler, J. J., Gross, B., Zamora, D. O. Characterization of an anterior segment organ culture model for open globe injuries. Scientific Reports. 11 (1), 8546 (2021).
- Erickson-Lamy, K., Rohen, J. W., Grant, W. M. Outflow facility studies in the perfused human ocular anterior segment. Experimental Eye Research. 52 (6), 723-731 (1991).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. The effect of organ culture on human trabecular meshwork. Experimental Eye Research. 49 (1), 113-127 (1989).
- Johnson, D. H., Tschumper, R. C. Human trabecular meshwork organ culture. A new method. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 28 (6), 945-953 (1987).
- Snider, E. J., et al. Improving stem cell delivery to the trabecular meshwork using magnetic nanoparticles. Scientific Reports. 8 (1), 12251 (2018).
- Llobet, A., Gasull, X., Gual, A. Understanding trabecular meshwork physiology: a key to the control of intraocular pressure. Physiology. 18 (5), 205-209 (2003).
- Goel, M., Picciani, R. G., Lee, R. K., Bhattacharya, S. K. Aqueous humor dynamics: A review. The Open Ophthalmology Journal. 4, 52-59 (2010).
- Snider, E. J., et al. Development of a porcine organ-culture glaucoma model mimicking trabecular meshwork damage. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 62 (3), 18 (2021).
- Ren, H., Wilson, G. Apoptosis in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 37 (6), 1017-1025 (1996).
- Komuro, A., Hodge, D. O., Gores, G. J., Bourne, W. M. Cell death during corneal storage at 4°C. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2827-2832 (1999).
- Crespo-Moral, M., García-Posadas, L., López-García, A., Diebold, Y. Histological and immunohistochemical characterization of the porcine ocular surface. PLOS One. 15 (1), e0227732 (2020).
- Wilson, S. E., Medeiros, C. S., Santhiago, M. R. Pathophysiology of corneal scarring in persistent epithelial defects after prk and other corneal injuries. Journal of Refractive Surgery. 34 (1), 59-64 (2018).
- Auw-Haedrich, C., et al. Immunohistochemical expression of epithelial cell markers in corneas with congenital aniridia and ocular cicatrizing pemphigoid. Acta Ophthalmologica. 89 (1), 47-53 (2011).
- Lyngholm, M., et al. Immunohistochemical markers for corneal stem cells in the early developing human eye. Experimental Eye Research. 87 (2), 115-121 (2008).
- Bandamwar, K. L., Papas, E. B., Garrett, Q. Fluorescein staining and physiological state of corneal epithelial cells. Contact Lens & Anterior Eye: The Journal of the British Contact Lens Association. 37 (3), 213-223 (2014).
- Bandamwar, K. L., Garrett, Q., Papas, E. B. Sodium fluorescein staining of the corneal epithelium: What does it mean at a cellular level. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (14), 6496 (2011).
- Sherwood, J. M., Reina-Torres, E., Bertrand, J. A., Rowe, B., Overby, D. R. Measurement of outflow facility using iPerfusion. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Weichel, E. D., Colyer, M. H., Ludlow, S. E., Bower, K. S., Eiseman, A. S. Combat ocular trauma visual outcomes during operations iraqi and enduring freedom. Ophthalmology. 115 (12), 2235-2245 (2008).
- Colyer, M. H., et al. Delayed intraocular foreign body removal without endophthalmitis during Operations Iraqi Freedom and Enduring Freedom. Ophthalmology. 114 (8), 1439-1447 (2007).
- Geggel, H. S., Maza, C. E. Anterior stromal puncture with the Nd:YAG laser. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 31 (8), 1555-1559 (1990).
- Matthews, A., et al. Indentation and needle insertion properties of the human eye. Eye. 28 (7), 880-887 (2014).
- Rau, A., et al. The mechanics of corneal deformation and rupture for penetrating injury in the human eye. Injury. 49 (2), 230-235 (2018).
- Agrawal, R., Ho, S. W., Teoh, S. Pre-operative variables affecting final vision outcome with a critical review of ocular trauma classification for posterior open globe (zone III) injury. Indian Journal of Ophthalmology. 61 (10), 541 (2013).
- Knyazer, B., et al. Prognostic factors in posterior open globe injuries (zone-III injuries). Clinical & Experimental Ophthalmology. 36 (9), 836-841 (2008).
- Tan, J., et al. C3 Transferase-Expressing scAAV2 Transduces Ocular Anterior Segment Tissues and Lowers Intraocular Pressure in Mouse and Monkey. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 17, 143-155 (2020).
- Bhattacharya, S. K., Gabelt, B. T., Ruiz, J., Picciani, R., Kaufman, P. L. Cochlin Expression in Anterior Segment Organ Culture Models after TGFβ2 Treatment. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (2), 551-559 (2009).
- Zhu, W., Godwin, C. R., Cheng, L., Scheetz, T. E., Kuehn, M. H. Transplantation of iPSC-TM stimulates division of trabecular meshwork cells in human eyes. Scientific Reports. 10 (1), 2905 (2020).
