פרופיל מרחבי של ביטוי חלבונים ורנ"א ברקמות: גישה לכוונון עדין של מיקרו-דיסקציה וירטואלית
Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לכוונון עדין של אזורי עניין (ROIs) עבור טכנולוגיות Spatial Omics כדי לאפיין טוב יותר את המיקרו-סביבה של הגידול ולזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות. עבור מבחני פרוטאומיקה, פרוטוקולים מותאמים אישית אוטומטיים יכולים להנחות את בחירת ההחזר על ההשקעה, בעוד שמבחני תמלול יכולים להיות מכווננים באמצעות ROIs קטנים עד 50 מיקרומטר.
Abstract
ריבוב מאפשר הערכה של מספר סמנים על אותה רקמה תוך מתן הקשר מרחבי. טכנולוגיות Spatial Omics מאפשרות ריבוב חלבונים ורנ”א על ידי מינוף נוגדנים ובדיקות המתויגים על ידי אוליגו הניתנים לביקוע, בהתאמה. אוליגוס נבקעים ומכמתים מאזורים ספציפיים ברחבי הרקמה כדי להבהיר את הביולוגיה הבסיסית. כאן, המחקר מדגים כי ניתן להשתמש בפרוטוקולים אוטומטיים של הדמיית נוגדנים מותאמים אישית כדי להנחות את בחירת ההחזר על ההשקעה בשילוב עם מבחני פרוטאומיקה מרחבית. שיטה ספציפית זו לא הראתה ביצועים מקובלים עם מבחני תעתיק מרחבי. הפרוטוקול מתאר פיתוח של בדיקה אימונופלואורסצנטית (IF) בת 3 פלקסים להדמיית סמנים על פלטפורמה אוטומטית, תוך שימוש בהגברת אות טירמיד (TSA) כדי להגביר את האות הפלואורסצנטי מיעד חלבון נתון ולהגדיל את מאגר הנוגדנים לבחירה. פרוטוקול ההדמיה היה אוטומטי באמצעות בדיקת 3-plex מאומתת ביסודיות כדי להבטיח איכות ויכולת שחזור. בנוסף, הוערכה החלפת DAPI בצבעי SYTO כדי לאפשר הדמיה של מבחני IF מבוססי TSA על פלטפורמת הפרופיל המרחבי. בנוסף, בדקנו את היכולת לבחור ROIs קטנים באמצעות מבחן התמלול המרחבי כדי לאפשר חקירה של תחומי עניין ספציפיים מאוד (למשל, אזורים מועשרים עבור סוג תא נתון). נאספו ROIs בקוטר 50 מיקרומטר ו-300 מיקרומטר, המתאימים לכ-15 תאים ו-100 תאים, בהתאמה. דגימות הוכנסו לספריות ורוצפו כדי לחקור את היכולת לזהות אותות מ-ROIs קטנים ומאזורים ספציפיים לפרופיל של הרקמה. קבענו שטכנולוגיות פרוטאומיקה מרחבית מפיקות תועלת רבה מפרוטוקולים אוטומטיים וסטנדרטיים שינחו את בחירת ההחזר על ההשקעה. בעוד שפרוטוקול ויזואליזציה אוטומטי זה לא היה תואם למבחני תעתיק מרחבי, הצלחנו לבדוק ולאשר שניתן לזהות בהצלחה אוכלוסיות תאים ספציפיות אפילו ב- ROIs קטנים באמצעות פרוטוקול ההדמיה הידני הסטנדרטי.
Introduction
ההתקדמות בטכניקות הריבוב ממשיכה לספק כלי אפיון טובים יותר למטרות הקיימות בגידולים. המיקרו-סביבה של הגידול (TME) היא מערכת מורכבת של תאי גידול, תאים חיסוניים חודרים וסטרומה, שבה מידע מרחבי הוא קריטי כדי להבין טוב יותר ולפרש מנגנונים של אינטראקציה בין סמנים ביולוגיים בעלי עניין1. עם טכניקות מתפתחות כגון GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) ו- 10x Visium, ניתן לזהות ולכמת מטרות מרובות בו זמנית בתוך ההקשר המרחבי שלהן. השימוש בפרוטוקולים אימונופלואורסצנטיים המאפשרים הדמיה של רקמות יכול לשפר עוד יותר את יכולות הפרופיל המרחבי של טכנולוגיות אלה.
טכנולוגיית ה-Spatial Omics בה התמקדנו לפיתוח שיטה זו מורכבת מפרוטאומיקה מרחבית ומבדיקות תעתיק שבהן אוליגונוקלאוטידים מחוברים לנוגדנים או לבדיקות RNA באמצעות מקשר רגיש ל-UV. שקופיות היסטולוגיות מסומנות בנוגדנים מצומדים לאוליגו או בגשושיות אלה, ולאחר מכן מוצגות בפלטפורמת הפרופיל המרחבי. לאחר מכן, ROIs של גדלים וצורות שונות נבחרים לתאורה, ואת oligonucleotides photocleaved שואפים ונאספים בלוח 96 באר. האוליגונוקלאוטידים הפוטוקלאוטידים מוכנים לכימות באמצעות מערכת ה-nCounter של ננו-מיתרים או עם ריצוף הדור הבא (NGS)2,3 (איור 1)4,5.
התפלגות התאים משתנה בתוך הרקמות, והיכולת לאפיין מיקומים ספציפיים של תאים באמצעות סמנים נבחרים וגדלי ROI שונים היא בעלת חשיבות רבה להבנה מלאה של סביבת הרקמה ולזיהוי תכונות ספציפיות. בטכנולוגיית Spatial Omics שהוזכרה כאן, פרוטוקול ההדמיה הסטנדרטי משתמש בנוגדנים מצומדים ישירות והוא פרוטוקול ידני. הסמנים הסטנדרטיים להבחנה בין גידול לסטרומה הם panCytokeratin (panCK) ו- CD45 6,7, אך סמנים נוספים נחוצים כדי להתמקד באוכלוסיות תאים ספציפיות המעניינות. יתר על כן, השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות חסר הגברה, המגבילה את בחירת הנוגדנים לסמנים בשפע. בנוסף, בדיקות ידניות כפופות לשונות רבה יותר מאשר זרימות עבודה אוטומטיות8. לכן, רצוי שיהיה פרוטוקול ויזואליזציה הניתן להתאמה אישית, אוטומטי ומוגבר לבחירת ROI.
כאן, המחקר מדגים כי עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, ניתן להשתמש בטכנולוגיית TSA לפרוטוקולי הדמיה בפלטפורמה אוטומטית וכתוצאה מכך לבצע בדיקה ממוקדת וסטנדרטית יותר. בנוסף, בדיקות מבוססות TSA מאפשרות שימוש בסמנים בעלי הבעה נמוכה, מה שמגדיל את טווח המטרות שניתן לבחור להדמיה. מבחן 3-plex עבור panCK, FAP ונוגדן X פותח באמצעות פלטפורמה אוטומטית שבה panCK ו- FAP שימשו להבחנה בין גידול לסטרומה, בהתאמה. נוגדן X הוא חלבון סטרומלי שנתקלים בו לעתים קרובות בגידולים, אך הביולוגיה שלו והשפעתו על חסינות אנטי-סרטנית אינן מובנות במלואן. אפיון ההקשר החיסוני באזורים עשירים בנוגדן X יכול להבהיר את תפקידו בחסינות נגד גידולים ובתגובה טיפולית, כמו גם את הפוטנציאל שלו כיעד תרופתי.
בעוד שלוחות הדמיה אוטומטיים מותאמים אישית של TSA הוכיחו את עצמם כמוצלחים עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, לא ניתן היה לאשר את היישום של מבחנים אלה עבור מבחני תעתיק מרחבי. הסיבה לכך היא ככל הנראה הריאגנטים והפרוטוקול המשמש לפרוטוקולי ההדמיה האוטומטיים, שנראה כי הם פוגעים בשלמות הרנ”א. ההכרה בכך שניתן להשתמש בפרוטוקול תיוג אוטומטי עבור סמני הדמיה עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, אך לא עבור מבחני תעתיק מרחבי, מספקת הדרכה חשובה לגבי עיצובי בדיקות בטכנולוגיית Spatial Omics.
בנוסף, המחקר מדגים כי ניתן להשתמש במבחן התמלול המרחבי כדי ליצור פרופיל מטרות באזורים קטנים עד 50 מיקרומטר קוטר, או כ-15 תאים. שני ROIs בגדלים שונים נבחרו כדי לבחון את היכולת של הבדיקה לזהות גם תעתיקים ב- ROIs קטנים. עבור כל אזור עניין, אוליגוס המתאימים ל-1,800 מטרות mRNA נאספו והפכו לספריות על פי פרוטוקול פלטפורמת הפרופיל המרחבי. ספריות אונדקסו בנפרד, לאחר מכן אוחדו ורוצפו. זה איפשר להעריך הן את יעילות האיגום והן את היכולת לזהות אוכלוסיות תאים ספציפיות ב-ROIs קטנים.
מאמר זה מראה כי עבור מבחני פרוטאומיקה מרחבית, ניתן להשתמש בפרוטוקול אוטומטי להנחיית בחירת ROI על סמנים ספציפיים בעלי עניין כדי למקד באופן סלקטיבי את החקירה של אזורי רקמה רלוונטיים ולאפיין את הסביבה המרחבית של הרקמה. יתר על כן, אנו מראים כי ניתן להשתמש ב-ROIs קטנים יותר עבור מבחני תעתיק מרחביים כדי לזהות ולאפיין אוכלוסיות תאים ספציפיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
נכון להיום, נוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות בפרוטוקול ידני משמשים לרוב כלוחות הדמיה עבור פרוטאומיקה מרחבית או מבחני תעתיק מרחבי 9,10. עם זאת, השימוש בנוגדנים פלואורסצנטיים מצומדים ישירות יכול להיות מאתגר עבור סמנים פחות בשפע, ולהגביל את בחירת הנוגדנים…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים לתומס וו על עיבוד קבצי NGS. אנו מודים לג’יימס זיאי על דיוני התוצאות וסקירת כתבי היד ולמרדית’ טריפלט ורייצ’ל טיילור על התיקון הפנימי של כתב היד.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
