Rumslig profilering av protein- och RNA-uttryck i vävnad: Ett tillvägagångssätt för att finjustera virtuell mikrodissektion
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för finjustering av regioner av intresse (ROI) för Spatial Omics-teknik för att bättre karakterisera tumörmikromiljön och identifiera specifika cellpopulationer. För proteomikanalyser kan automatiserade anpassade protokoll styra ROI-valet, medan transkriptomikanalyser kan finjusteras med hjälp av ROI så små som 50 μm.
Abstract
Multiplexering möjliggör bedömning av flera markörer på samma vävnad samtidigt som det ger rumsligt sammanhang. Spatial Omics-teknik möjliggör både protein- och RNA-multiplexering genom att utnyttja fotoklyvbara oligomärkta antikroppar respektive sonder. Oligos klyvs och kvantifieras från specifika regioner över vävnaden för att belysa den underliggande biologin. Här visar studien att automatiserade anpassade antikroppsvisualiseringsprotokoll kan användas för att vägleda ROI-val i samband med rumsliga proteomikanalyser. Denna specifika metod visade inte acceptabel prestanda med rumsliga transkriptomikanalyser. Protokollet beskriver utvecklingen av en 3-plex immunofluorescerande (IF) analys för markörvisualisering på en automatiserad plattform, med hjälp av tyramidsignalförstärkning (TSA) för att förstärka den fluorescerande signalen från ett givet proteinmål och öka antikroppspoolen att välja mellan. Visualiseringsprotokollet automatiserades med hjälp av en noggrant validerad 3-plex-analys för att säkerställa kvalitet och reproducerbarhet. Dessutom utvärderades utbytet av DAPI mot SYTO-färgämnen för att möjliggöra avbildning av TSA-baserade IF-analyser på den rumsliga profileringsplattformen. Dessutom testade vi möjligheten att välja små ROI med hjälp av den rumsliga transkriptomikanalysen för att möjliggöra undersökning av mycket specifika intresseområden (t.ex. områden berikade för en viss celltyp). ROI med 50 μm och 300 μm diameter samlades in, vilket motsvarar cirka 15 celler respektive 100 celler. Prover gjordes till bibliotek och sekvenserades för att undersöka förmågan att detektera signaler från små ROI och profilspecifika regioner i vävnaden. Vi bestämde oss för att rumsliga proteomiktekniker drar stor nytta av automatiserade, standardiserade protokoll för att vägleda ROI-urval. Även om detta automatiserade visualiseringsprotokoll inte var kompatibelt med rumsliga transkriptomikanalyser, kunde vi testa och bekräfta att specifika cellpopulationer framgångsrikt kan detekteras även i små ROI med standardprotokollet för manuell visualisering.
Introduction
Framsteg inom multiplexeringstekniker fortsätter att ge bättre karakteriseringsverktyg för mål som finns i tumörer. Tumörmikromiljön (TME) är ett komplext system av tumörceller, infiltrerande immunceller och stroma, där rumslig information är avgörande för att bättre förstå och tolka mekanismer för interaktion mellan biomarkörer av intresse1. Med nya tekniker som GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) och 10x Visium kan flera mål detekteras och kvantifieras samtidigt inom sitt rumsliga sammanhang. Användningen av immunofluorescensprotokoll som underlättar vävnadsvisualisering kan ytterligare förbättra de rumsliga profileringsfunktionerna för dessa tekniker.
Den Spatial Omics-teknik vi fokuserat på för denna metodutveckling består av rumsliga proteomik- och transkriptomikanalyser där oligonukleotider är fästa vid antikroppar eller RNA-sonder via en UV-känslig fotokleaverbar länkare. Histologiska diabilder märks med dessa oligokonjugerade antikroppar eller sonder och avbildas sedan på den rumsliga profileringsplattformen. Därefter väljs ROI av olika storlekar och former för belysning, och de fotoklyvade oligonukleotiderna aspireras och samlas i en 96-brunnsplatta. De fotokleaverade oligonukleotiderna bereds för att kvantifieras med antingen nanosträng nCounter-systemet eller nästa generations sekvensering (NGS)2,3 (figur 1)4,5.
Cellfördelningar varierar inom vävnader, och förmågan att karakterisera specifika platser för celler med hjälp av utvalda markörer och olika ROI-storlekar är av stor betydelse för att fullt ut förstå vävnadsmiljön och identifiera specifika egenskaper. I Spatial Omics-tekniken som nämns här använder standardvisualiseringsprotokollet direkt konjugerade antikroppar och är ett manuellt protokoll. Standardmarkörerna för att skilja mellan tumör och stroma är panCytokeratin (panCK) och CD456,7, men ytterligare markörer är nödvändiga för att rikta in sig på specifika cellpopulationer av intresse. Dessutom saknar användningen av direkt konjugerade fluorescerande antikroppar förstärkning, vilket begränsar antikroppsselektionen till rikliga markörer. Dessutom är manuella analyser föremål för mer variation än automatiserade arbetsflöden8. Därför är det önskvärt att ha ett anpassningsbart, automatiserat och förstärkt visualiseringsprotokoll för ROI-val.
Här visar studien att TSA-teknik för rumsliga proteomikanalyser kan användas för visualiseringsprotokoll på en automatiserad plattform vilket resulterar i en mer riktad och standardiserad analys. Dessutom möjliggör TSA-baserade analyser användning av låguttryckande markörer, vilket ökar utbudet av mål som kan väljas för visualisering. En 3-plexanalys för panCK, FAP och Antibody X utvecklades med hjälp av en automatiserad plattform där panCK och FAP användes för att skilja mellan tumör respektive stroma. Antikropp X är ett stromalt protein som ofta förekommer i tumörer, men dess biologi och inverkan på antitumörimmunitet är inte helt förstådda. Att karakterisera immunkontextur i områden som är rika på antikropp X kan belysa dess roll i antitumörimmunitet och terapeutiskt svar, liksom dess potential som läkemedelsmål.
Medan anpassade automatiserade TSA-visualiseringspaneler visade sig vara framgångsrika för rumsliga proteomikanalyser, kunde tillämpningen av dessa analyser för rumsliga transkriptomikanalyser inte bekräftas. Detta beror troligen på reagenserna och protokollet som används för de automatiserade visualiseringsprotokollen, som verkar äventyra RNA-integriteten. Att erkänna att ett automatiserat märkningsprotokoll för visualiseringsmarkörer kan användas för rumsliga proteomikanalyser men inte för rumsliga transkriptomikanalyser ger viktig vägledning om Spatial Omics-teknikanalysdesign.
Dessutom visar studien att den rumsliga transkriptomikanalysen kan användas för att profilera mål i regioner så små som 50 μm i diameter, eller cirka 15 celler. Två roi:er av olika storlek valdes för att testa analysens förmåga att även upptäcka transkriptioner i små ROI:er. För varje region av intresse samlades oligos motsvarande 1 800 mRNA-mål in och gjordes till bibliotek enligt protokollet för rumslig profileringsplattform. Biblioteken indexerades individuellt, poolades därefter och sekvenserades. Detta möjliggjorde utvärderingen av både poolningseffektivitet och förmågan att identifiera specifika cellpopulationer i små ROI.
Detta dokument visar att för rumsliga proteomikanalyser kan ett automatiserat protokoll för att styra ROI-val på specifika markörer av intresse användas för att selektivt rikta in sig på förhör av relevanta vävnadsområden och karakterisera vävnadens rumsliga miljö. Dessutom visar vi att mindre ROI kan användas för rumsliga transkriptomiska analyser för att upptäcka och karakterisera specifika cellpopulationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hittills används direkt konjugerade fluorescerande antikroppar i ett manuellt protokoll oftast som visualiseringspaneler för rumslig proteomik eller rumslig transkriptomikanalys 9,10. Användningen av direkt konjugerade fluorescerande antikroppar kan dock vara utmanande för mindre rikliga markörer, vilket begränsar valet av lämpliga antikroppar. Detta protokoll visar att märkning av visualiseringsmarkörer kan automatiseras på en automatiserad färgningsp…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner Thomas Wu för bearbetning av NGS-filer. Vi tackar James Ziai för resultatdiskussionerna och manuskriptgranskningen och Meredith Triplet och Rachel Taylor för intern manuskriptrevision.
Materials
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572 (2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J. New tools for pathology: a user’s review of a highly multiplexed method for in situ analysis of protein and RNA expression in tissue. Journal of Pathology. 247 (5), 650-661 (2019).
- McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization. Journal of Pathology. 254 (4), 405-417 (2021).
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/products/geomx-digital-spatial-profiler/geomx-dsp-overview (2022)
- . NanoString. GeoMx Digital Spatial Profiler Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/BR_MK0981_GeoMx_Brochure_r19_FINAL_Single_WEB.pdf (2022)
- McCart Reed, A. E., et al. Digital spatial profiling application in breast cancer: a user’s perspective. Virchows Arch: An International Journal of Pathology. 477 (6), 885-890 (2020).
- McNamara, K. L., et al. Spatial proteomic characterization of HER2-positive breast tumors through neoadjuvant therapy predicts response. Nature Cancer. 2 (4), 400-413 (2021).
- Kim, S. W., Roh, J., Park, C. S. Immunohistochemistry for pathologists: Protocols, pitfalls, and tips. Journal of Pathology and Translational Medicine. 50 (6), 411-418 (2016).
- Muñoz, N. M., et al. Molecularly targeted photothermal ablation improves tumor specificity and immune modulation in a rat model of hepatocellular carcinoma. Communications Biology. 3 (1), 783 (2020).
- Coleman, M., et al. Hyaluronidase impairs neutrophil function and promotes Group B Streptococcus invasion and preterm labor in nonhuman primates. mBio. 12 (1), 03115-03120 (2021).
- Gupta, S., Zugazagoitia, J., Martinez-Morilla, S., Fuhrman, K., Rimm, D. L. Digital quantitative assessment of PD-L1 using digital spatial profiling. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 100 (10), 1311-1317 (2020).
- Carter, J. M., et al. Characteristics and spatially defined immune (micro)landscapes of early-stage PD-L1-positive triple-negative breast cancer. Clinical Cancer Research. 27 (20), 5628-5637 (2021).
- Busse, A., et al. Immunoprofiling in neuroendocrine neoplasms unveil immunosuppressive microenvironment. Cancers. 12 (11), 3448 (2020).
- Kulasinghe, A., et al. Profiling of lung SARS-CoV-2 and influenza virus infection dissects virus-specific host responses and gene signatures. European Respiratory Journal. 59 (1), (2021).
- Li, X., Wang, C. Y. From bulk, single-cell to spatial RNA sequencing. International Journal of Oral Science. 13 (36), (2021).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user’s perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Introduction to GeoMx Normalization: Protein. White Paper. Nanostring Available from: https://nanostring.com/wp-content/uploads/MK2593_GeoMx_Normalization-Protein.pdf (2020)
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the geomx spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Hwang, W. L., et al. Single-nucleus and spatial transcriptomics of archival pancreatic cancer reveals multi-compartment reprogramming after neoadjuvant treatment. BioRxiv. , (2020).
- Jerby-Arnon, L., et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nature Medicine. 27 (2), 289-300 (2021).
