Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical
Summary
Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).
Abstract
Cilia primária (PC) são organelas dinâmicas de microtúbulos não motil que se projetam da superfície da maioria das células mamíferas. Eles emergem do centríclulo mais antigo durante a fase G1/G0 do ciclo celular, enquanto desmontam à medida que as células reentram no ciclo celular no limite da fase G2/M. Eles funcionam como hubs de sinal, detectando e transduzindo sinais extracelulares cruciais para muitos processos celulares. Semelhante à maioria dos tipos de células, todas as células-tronco neurais neocorticais e progenitoras (NSPCs) têm sido mostradas abrigando um PC permitindo-lhes sentir e transduzir sinais específicos necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para gerar e caracterizar modelos bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) baseados em células-tronco de células-tronco induzidas por humanos (hIPSCs) para dissecar ainda mais o envolvimento do PC durante o desenvolvimento neocortical. Em particular, apresentamos protocolos para estudar a biogênese do PC e funcionar em NSPCs derivados de roseta neural 2D, incluindo a transdução da via Sonic Hedgehog (SHH). Para aproveitar a organização tridimensional (3D) de organoides cerebrais, descrevemos um método simples para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos. Após a limpeza óptica, a rápida aquisição de organoides inteiros permite a detecção de centrossomos e PC em progenitores neocorticais e neurônios de todo o organoide. Por fim, detalhamos o procedimento de imunostenção e compensação de seções organoides de flutuação livre espessa preservando um grau significativo de informações espaciais 3D e permitindo a aquisição de alta resolução necessária para a análise qualitativa e quantitativa detalhada da biogênese e função do PC.
Introduction
Cílios primários (PC) são organelas à base de microtúbulos que sentem e transduzem uma infinidade de pistas químicas e mecânicas do ambiente extracelular. Em particular, pc é a organela central para a transdução da via de sinalização hedgehog em vertebrados1,2. Embora a maioria das células neurais tenham sido mostradas há muito tempo abrigando um PC, a contribuição desta organela na formação do sistema nervoso central tem sido há muito desvalorizada. Estudos sobre desenvolvimento neocortical levaram à descoberta de múltiplas células-tronco neurais e progenitoras (NSPCs), todas abrigando um PC, local que foi proposto para ser crucial para a determinação do destino progenitora3,4,5,6,7. O PC tem sido mostrado crucial para os mecanismos celulares necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal, incluindo a expansão do NSPC e o compromisso de 8,9,10,11,12, bem como a polaridade apicobasal do andaime glial radial que suporta a migração neuronal13. Além disso, pc são necessários durante a migração tangencial de interneurons para a placa cortical14,15. Finalmente, foi proposto um papel para o PC no estabelecimento de conexões sinápticas de neurônios no córtex cerebral16,17. Ao todo, esses achados defendem um papel crucial do PC nas principais etapas do desenvolvimento cortical cerebral18,19 e levantam a necessidade de investigar seu envolvimento nos mecanismos patológicos subjacentes às anomalias do desenvolvimento cortical cerebral.
Estudos recentes melhoraram em grande parte nossa compreensão de importantes diferenças celulares e moleculares entre o desenvolvimento cortical em modelos humanos e animais, enfatizando a necessidade de desenvolver sistemas de modelos humanos. Nessa visão, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hIPSCs) representam uma abordagem promissora para estudar a patogênese da doença em um contexto genético e celular relevante. Modelos bidimensionais aderentes (2D) ou rosetas neurais contêm NSPCs semelhantes aos vistos no córtex cerebral em desenvolvimento, que se organizam em estruturas em forma de roseta mostrando polaridade apicobasal correta20,21,22. Além disso, o sistema de cultura tridimensional (3D) permite a geração de organoides forebraínicos dorsais que recapitulam muitas características do desenvolvimento cortical cerebral humano23,24,25,26. Essas duas abordagens complementares de modelagem baseada em células oferecem perspectivas interessantes para dissecar o envolvimento do PC durante o desenvolvimento normal e patológico do córtex cerebral.
Aqui, fornecemos protocolos detalhados para a geração e caracterização de rosetas neurais e NSPCs derivadas, bem como organoides forebraínicos dorsais. Também fornecemos protocolos detalhados para analisar a biogênese e a função do PC presente nos NSPCs, testando a transdução da via Sonic Hedgehog e analisando a dinâmica das moléculas cruciais envolvidas nesse caminho. Para aproveitar a organização 3D dos organoides cerebrais, também criamos um método simples e econômico para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos permitindo a rápida aquisição, graças a um microscópio de folha de luz, de todo o organoide, com alta resolução permitindo visualizar PC em todos os tipos de progenitores neocorticais e neurônios de todo o órgãoide. Finalmente, adaptamos a imunohistoquímica em seções flutuantes livres de 150 μm com compensação e aquisição subsequentes usando microscópio confocal de varredura ressonante permitindo a aquisição de imagens de alta resolução, o que é necessário para a análise detalhada da biogênese e função do PC. Especificamente, o software de imagem 3D permite a reconstrução 3D do PC com análise subsequente de parâmetros morfológicos, incluindo comprimento, número e orientação do PC, bem como medição da intensidade do sinal de componentes ciliares ao longo do axoneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
O PC é agora considerado como organelas-chave que regulam etapas cruciais durante o desenvolvimento cortical cerebral normal18,19,31, incluindo a expansão e o compromisso do NSPC 8,9,10,11,12, bem como migração neuronal13,14<sup …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por subvenções da Agence Nationale de la Recherche (ANR) para S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). A LB é apoiada pelo programa AnR under Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) e pelo Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). O Instituto Imagine é apoiado pelo financiamento estatal da ANR no âmbito do programa Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, projetos CrossLab) e como parte do segundo programa Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
Materials
| 2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
| 96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
| B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
| CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
| EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
| EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
| FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
| KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
| Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
| Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
| Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
| Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
| TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| Primary Antibodies | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
| P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
| Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
| Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
References
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