एक बेहद सटीक इन विट्रो हाई-थ्रूपुट परख प्रणाली को कैंसर के ऊतकों के समान रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) का उपयोग करके कैंसर रोधी दवाओं का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था, लेकिन 96-अच्छी तरह से और 384-अच्छी प्लेटों के साथ इन विट्रो हाई-थ्रूपुट परख प्रणालियों के लिए अनुपयुक्त हैं।
रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) को पारंपरिक सेल कल्चर मॉडल की तुलना में रोग की बेहतर प्रजनन क्षमता के साथ एक प्रीक्लीनिकल कैंसर मॉडल होने की उम्मीद है। पीडीओ को ट्यूमर ऊतक के वास्तुकला और कार्य को सही और कुशलता से पुनः प्राप्त करने के लिए विभिन्न प्रकार के मानव ट्यूमर से सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया है। हालांकि, पीडीओ एंटीकैंसर दवाओं का मूल्यांकन करते समय 96-अच्छी तरह से या 384-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग करके इन विट्रो हाई-थ्रूपुट परख प्रणाली (एचटीएस) या सेल विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त हैं क्योंकि वे आकार में विषम हैं और संस्कृति में बड़े समूह बनाते हैं। ये संस्कृतियां और परख ट्यूमर ऊतक मचान बनाने के लिए मैट्रिक्स जैसे एक्सपेरि़लर मैट्रिस का उपयोग करते हैं। इसलिए, पीडीओ के पास कम थ्रूपुट और उच्च लागत है, और एक उपयुक्त परख प्रणाली विकसित करना मुश्किल हो गया है। इस मुद्दे को हल करने के लिए, एंटीकैंसर दवाओं और इम्यूनोथेरेपी की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए पीडीओ का उपयोग करके एक सरल और अधिक सटीक एचटीएस स्थापित किया गया था। एक इन विट्रो एचटीएस बनाया गया था जो 384-वेल प्लेटों में सुसंस्कृत ठोस ट्यूमर से स्थापित पीडीओ का उपयोग करता है। 96-वेल प्लेटों में सुसंस्कृत पीडीओ का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिकिटी गतिविधि के मूल्यांकन के लिए एक एचटीएस भी विकसित किया गया था।
मानव कैंसर सेल लाइनों को व्यापक रूप से कैंसर के जीव विज्ञान का अध्ययन करने और कैंसर रोधी एजेंटों का मूल्यांकन करने के लिए स्वीकार किया जाता है। हालांकि, ये सेल लाइनें जरूरी नहीं कि उनके स्रोत ऊतक की मूल विशेषताओं को संरक्षित करें क्योंकि उनकी आकृति विज्ञान, जीन उत्परिवर्तन और जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल लंबी अवधि में संस्कृति के दौरान बदल सकती है। इसके अलावा, इनमें से अधिकांश सेल लाइनों को मोनोलेयर में सुसंस्कृत किया जाता है या मुरीन ज़ेनोग्रॉफ्ट के रूप में उपयोग किया जाता है, जिनमें से कोई भी शारीरिक रूप से ट्यूमर ऊतक1,2का प्रतिनिधित्व नहीं करता है। इस प्रकार, कैंसर रोधी एजेंटों की नैदानिक प्रभावकारिता कैंसर सेल लाइनों में देखी गई वैसी नहीं हो सकती है। इसलिए, इन विट्रो सिस्टम, जैसे कि रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफेफ्ट या रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनॉइड (पीडीओ) और ट्यूमर स्फेरोइड मॉडल का उपयोग करके पूर्व वीवो परख विकसित की गई है। बढ़ते सबूत पता चलता है कि इन मॉडलों को सीधे इसी कैंसर के ऊतकों के लिए तुलनीय जा रहा द्वारा कैंसर रोधी एजेंटों के लिए रोगियों की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी । ये इन इन विट्रो सिस्टम विभिन्न ट्यूमर ऊतक प्रकारों के लिए स्थापित किए गए हैं, और दवा स्क्रीनिंग के लिए संबद्ध उच्च-थ्रूपुट परख प्रणाली (एचटीएस) भी विकसित की गई है3,4,5,6,7। रोगियों या रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट से प्राप्त प्राथमिक ट्यूमर की विषम पूर्व वीवो ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों ने हाल के वर्षों में संस्कृति की आसानी और स्ट्रोमल ऊतक8, 9, 10में कोशिकाओं की जटिलता को बनाए रखने की क्षमता के कारण काफीकर्षणप्राप्त किया है। इन मॉडलों से कैंसर के जीव विज्ञान की समझ में वृद्धि होने और विट्रो मेंदवा प्रभावकारिता के मूल्यांकन में मदद मिलने की उम्मीद है ।
उपन्यास पीडीओ की एक श्रृंखला हाल ही में फुकुशिमा ट्रांसलेशनल रिसर्च प्रोजेक्ट के तहत एफ-पीडीओ के रूप में नामित विभिन्न प्रकार के ट्यूमर ऊतकों से बनाई गई थी । पीडीओ बड़े सेल क्लस्टर बनाते हैं , जिनमें स्रोत ट्यूमर के समान आकृति विज्ञान होता है और इसे छहमहीनेसे अधिक समय तक सुसंस्कृत किया जा सकता है । तुलनात्मक हिस्टोलॉजी और व्यापक जीन अभिव्यक्ति विश्लेषणों से पता चला है कि पीडीओ की विशेषताएं संस्कृति की स्थितियों के तहत लंबे समय तक विकास के बाद भी उनके स्रोत ट्यूमर ऊतकों के करीब हैं । इसके अलावा, 96-वेल और 384-वेल प्लेटों में प्रत्येक प्रकार के पीडो के लिए एक उपयुक्त एचटीएस स्थापित किया गया था। इन परख का उपयोग कई आणविक लक्षित एजेंटों और एंटीबॉडी का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। यहां, एंडोमेट्रियल कैंसर के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक कीमोथेरेपी (पैकिटैक्सेल और कार्बोप्लैटिन) का मूल्यांकन एक रोगी से प्राप्त एफ-पीडीओ का उपयोग करके किया गया था, जिन्होंने paclitaxel और कार्बोप्लैटिन का जवाब नहीं दिया था। तदनुसार, इस पीडीओ के खिलाफ paclitaxel और कार्बोप्लैटिन की सेल विकास निरोधात्मक गतिविधि कमजोर थी (आईसी50:>10 माइक्रोनएम)। इसके अलावा, पिछले शोध में बताया गया है कि कीमोथैरेपी एजेंटों और आणविक लक्षित एजेंटों के लिए कुछ एफ-पीडीओ की संवेदनशीलता नैदानिक प्रभावकारिता11,12, 13के अनुरूप है। अंत में, कैंसर रोधी एजेंटों के कारण पीडीओ की उच्च-क्रम संरचना में परिवर्तनों का विश्लेषण त्रि-आयामी कोशिका विश्लेषण प्रणाली12,13का उपयोग करके किया गया था। पीडो-आधारित एचटीएस का उपयोग करके कैंसर रोधी एजेंटों के मूल्यांकन के परिणाम इन एजेंटों के लिए प्राप्त नैदानिक परिणामों के साथ तुलनीय हैं। यहां, एक प्रोटोकॉल एक सरल और अधिक सटीक एचटीएस के लिए प्रस्तुत किया जाता है जिसका उपयोग पीडो मॉडल का उपयोग करके एंटीकैंसर एजेंटों और इम्यूनोथेरेपी की शक्ति का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
पीडीओ की अनूठी विशेषता यह है कि वे संस्कृति या परख के दौरान एक कोशिकाओं में एंजाइमेटिक रूप से अलग नहीं होते हैं और संस्कृति में कोशिका समूहों को बनाए रखते हैं। इसलिए, कोशिकाओं की संख्या को माइक्रोस्कोप के नीचे सही ढंग से नहीं गिना जा सकता है। इस समस्या को हल करने के लिए, कोशिकाओं की संख्या नेत्रहीन एक अपकेंद्रित्र ट्यूब 50-200 μL(चित्रा 1B)के लिए स्तर के साथ चिह्नित ट्यूबों के साथ कोशिकाओं युक्त अस्तर द्वारा निर्धारित किया जाता है । इसके अलावा, क्योंकि 25 सेमी2 फ्लास्क में सुसंस्कृत सेल क्लस्टर की गोली की मात्रा को मापना मुश्किल है, इसलिए पारित होने का समय लाल से पीले रंग तक मध्यम रंग परिवर्तन और संकेतकों के रूप में पासेजिंग के समय की तुलना में एकल कोशिकाओं या मलबे में उल्लेखनीय वृद्धि का उपयोग करके निर्धारित किया गया था(चित्रा 1A,सी)। यह पीडीओ के लिए पासिंग की बात है। प्रत्येक माध्यम परिवर्तन पर अपकेंद्रित्र के बाद पीडीओ छर्रों की मात्रा नेत्रहीन मापी जाती है। जब गोली की मात्रा बढ़ना बंद हो जाती है, और मध्यम प्रतिस्थापन के बाद दिन में मध्यम पीला हो जाता है, तो माध्यम को घनत्व के साथ संतृप्त माना जाता है, और पासेजिंग किया जाता है। प्रत्येक पीडो के लिए गोली की मात्रा परिभाषित की गई है। यदि पीडीओ पैदा नहीं करते हैं, तो मध्यम विनिमय के समय मध्यम की मात्रा 80% से बदलकर 50% कर दी जाती है, और संस्कृति में पीडीओ का घनत्व बढ़ जाता है।
पीडीओ के लिए उपयुक्त एचटीएस विकसित किया गया था। इसका थ्रूपुट कम से कम दस से बीस 384-अच्छी प्लेटें हैं जो पीडो के 1 75 सेमी2 फ्लास्क का उपयोग करके प्रदर्शन की जाती हैं, और प्रति दिन संसाधित प्लेटों की संख्या कम से कम 50 है। इसके अलावा पीडीओ का उपयोग करते हुए एचटीएस द्वारा विभिन्न कैंसर रोधी दवाओं के मूल्यांकन के परिणाम पहले ही सूचित किए जा चुके हैं ।
एचटीएस का प्रदर्शन करते समय, सेल विखंडन और फैलाव उपकरण का उपयोग करके एफ-पीडीओ की की कमी के कारण जाल फिल्टर की क्लोजिंग को शुरू में फिल्टर के जाल आकार को 100 माइक्रोन में बदलकर संबोधित किया जाता है। अगला कदम ग्लास पोत पर लागू पीडो निलंबन की मात्रा को कम करना है। एचटीएस के लिए परीक्षण पदार्थ समाधान तैयार करते समय, कम आणविक-वजन यौगिक आमतौर पर डाइमेथाइल सल्फोक्साइड में भंग हो जाते हैं, और एंटीबॉडी फॉस्फेट-बफर खारा में भंग हो जाते हैं। उपयुक्त सॉल्वेंट का उपयोग परीक्षण पदार्थ के रूप में किया जाता है, और नियंत्रण डेटा उपयोग किए गए सॉल्वेंट से प्राप्त किया जाता है।
निम्नलिखित परख डेटा में परिवर्तनशीलता से निपटने के तरीके का वर्णन है। यदि ३८४-अच्छी प्लेटों का उपयोग कर परीक्षण में डेटा में बड़ी भिन्नता है, तो परख प्लेट को ९६-अच्छी प्लेट प्रारूप में बदल दिया जाना चाहिए । प्लेट को सीडिंग करने के बाद पीडो तनुशन फैक्टर (वरीयता प्राप्त सेल क्लस्टर्स की संख्या) की भी जांच की जाती है। अंत में, सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम का उपयोग परख के लिए पीडीओ के आकार का चयन करने के लिए किया जा सकता है। चैंबर में पीडीओ को जोड़ने से पहले, एकल कोशिकाओं और छोटे सेल क्लस्टर को कम गति वाले अपकेंद्रित्र द्वारा हटा दिया जाना चाहिए ताकि पीडीओ को सही ढंग से पहचाना जा सके । यदि कक्ष में पीडीओ जोड़ने के बाद एकल कोशिकाएं या छोटे सेल क्लस्टर दिखाई देते हैं, तो एकल कोशिकाओं को हटाने के लिए कई फैलाव किए जा सकते हैं। इसके बाद, हालांकि सेल पिकिंग और इमेजिंग सिस्टम में एक फ़ंक्शन होता है जो प्लेट को गर्म रखने की अनुमति देता है, इस फ़ंक्शन का उपयोग संस्कृति माध्यम के वाष्पीकरण के कारण नहीं किया जाता है जब सिस्टम लंबे समय तक काम कर रहा होता है। अंत में, सेल समूहों की मात्रा अज्ञात है क्योंकि यह एक प्लैनर छवि द्वारा पहचाना जाता है। इसके अलावा, यदि दो या अधिक पीडीओ ओवरलैप करते हैं, तो एक भी पीडीओ को सही ढंग से मान्यता नहीं दी जा सकती है। हालांकि, इस कदम के बाद स्कैन की गई छवि पर उनकी जांच करके हटाने के कार्य का उपयोग करके अवांछित पीडीओ को हटाना संभव है।
विद्युत बाधा मापने के उपकरण आम तौर पर पालन लक्ष्य कैंसर कोशिकाओं के लिए कोशिका प्रसार के दौरान बाधा में परिवर्तन की निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है । इसलिए, गैर-पालनकारी पीडीओ के सेल इंडेक्स में बदलाव का पता नहीं चल पाता है। इस समस्या को हल करने के प्रयास में, पीडो के प्रकार के आधार पर पीडो घनत्व और एंजाइमीय उपचार (सेल वियोजन एंजाइम और उपचार समय) जैसी सीडिंग स्थितियों की जांच करना आवश्यक है। प्लेट में कुओं को पीडीओ सीडिंग के लिए एक उपयुक्त एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स के साथ भी लेपित किया जाना चाहिए। पीडीओ को पीडीओ के प्रकार के आधार पर एंजाइमेटिक उपचार के बिना वरीयता दी जाती है। RLUN007 का उपयोग एंजाइमेटिक उपचार द्वारा उन्हें फैलाने के बाद 96-अच्छी प्लेट पर पीडीओ को सीडिंग करके बाधा को मापने के लिए किया गया था। RLUN007 कोशिकाओं को तितर-बितर करने और उन्हें 96-अच्छी प्लेट के कुओं से जोड़ने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए सेल संस्कृति वियोजन रिएजेंट के साथ इलाज किया गया था। यह देखते हुए कि अलग RLUN007 कोशिकाओं को तुरंत समुच्चय फार्म, यह सिर्फ एक छलनी का उपयोग कर छानने के बाद प्लेटों पर बीज के लिए वांछनीय है । ट्यूब से एक जलाशय के लिए सेल निलंबन स्थानांतरित करने के बाद, जलाशय धीरे से दो से तीन बार छोड़ दिया और ऊपर और नीचे पांच बार थाली पर बोने से पहले पाइप्ड किया गया था । निलंबन भी कुएं के लिए प्रत्येक अतिरिक्त के साथ मिलाया गया था । थाली तो 30 मिनट के लिए एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में रखा गया था (पीडीओ के लिए) या 15 मिनट (एनके कोशिकाओं के लिए) कोशिकाओं को अच्छी तरह से समान रूप से वितरित करने की अनुमति है । दूसरी महत्वपूर्ण बात यह है कि एंटीबॉडी और एनके कोशिकाओं के साथ उपचार समय पर होना चाहिए इससे पहले कि सेल सूचकांक एक पठार तक पहुंचता है और मूल्य ०.५ से कम नहीं है । RLUN007 के मामले में, परख शुरू करने के लिए इष्टतम समय चढ़ाना के बाद 20-22 घंटे है, और सीडिंग के लिए सेल संख्या 5 x 104 कोशिकाओं/
सामान्य तौर पर, ट्यूमर ऑर्गेनॉइड के लिए संस्कृति और परख में ट्यूमर ऊतक मचान या एंजाइम जैसे ट्राइप्सिन और कोलेजनेस जैसे ट्यूमर ऊतक मचान बनाने के लिए मैट्रिक्स जैसे एक्सपेरिमेंटीय मैट्रिस का उपयोग किया जाता है ताकि ऑर्गेनॉइड 3 ,4,5,6,7,7को बाधित किया जा सके। इस विधि का लाभ यह है कि संस्कृति और परख के दौरान कोई बाह्य मैट्रिक्स या एंजाइमेटिक उपचार की आवश्यकता नहीं है (विद्युत बाधा मापने वाले उपकरण का उपयोग करके परख के अलावा), जो श्रम आवश्यकताओं और लागतों को काफी कम कर देता है। इसके अलावा, यह विधि एचटीएस परख प्रणालियों और विभिन्न माप प्रणालियों के अनुकूल होना अपेक्षाकृत आसान है। हालांकि, एक बाह्य मैट्रिक्स का उपयोग कुछ शोध उद्देश्यों के लिए वांछनीय है क्योंकि यह कोशिकाओं के लिए एक पाड़ के रूप में कार्य कर सकता है और ऊतकों में मॉर्फोजेनेसिस, भेदभाव और होमोस्टेसिस को प्रभावित कर सकता है।
इस अध्ययन में, ईजीएफआर म्यूटेशन (एल858आर) के साथ पीडीओ (आरएलयूएन007) जो ईजीएफआर अवरोधकों के प्रति चिकित्सकीय रूप से संवेदनशील है और ईजीएफआर जीन (डेटा नहीं दिखाया गया) की उच्च अभिव्यक्ति का उपयोग ईजीएफआर अवरोधकों का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। यह दर्शाया गया था कि आरएलयूआर अवरोधकों के लिए आरएलयूआर 007 की संवेदनशीलता अन्य फेफड़ों के कैंसर से व्युत्पन्न एफ-पीडीओ13 (चित्रा 4)की तुलना में अधिक थी। इस प्रकार, पीडीओ का उपयोग करके एक एचटीएस, जो ट्यूमर ऊतक की विशेषताओं को बनाए रखता है, संभावित कैंसर रोधी एजेंटों के मूल्यांकन के लिए बेहतर है और दवा मूल्यांकन और व्यक्तिगत चिकित्सा में प्रगति के लिए अवसर प्रस्तुत करता है। हालांकि एचटीएस एजेंटों की प्रारंभिक स्क्रीनिंग के लिए उपयुक्त है, यह ट्यूमर माइक्रोएनवायरमेंट को पुन: पेश नहीं करता है और इस प्रकार वीवो मेंदवाओं की प्रभावकारिता का मूल्यांकन नहीं कर सकता है। इसलिए, एक इन विट्रो प्रणाली जो वीवो में मानव ट्यूमर ऊतक की नकल कर सकती है, सह-संस्कृति द्वारा वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं और अन्य स्ट्रोमल कोशिकाओं या पशु मॉडलों के अभाव में अंग-ऑन-ए-चिप तकनीक के साथ अब विकास के तहत है ।
The authors have nothing to disclose.
हम रोगियों को जो नैदानिक नमूनों इस शोध में इस्तेमाल प्रदान का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । यह शोध फुकुशिमा प्रांत के ट्रांसलेशनल रिसर्च प्रोग्राम से अनुदान द्वारा समर्थित है।
384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
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CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
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TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
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