En meget præcis in vitro high-throughput assay system blev udviklet til at evaluere anticancer narkotika ved hjælp af patient-afledt tumor organoider (BOB’er), svarende til kræft væv, men er uegnede til in vitro high-throughput assay systemer med 96-brønd og 384-brønd plader.
Patient-afledt tumor organoider (PDO’er) forventes at være en præklinisk kræft model med bedre reproducerbarhed af sygdom end traditionelle cellekultur modeller. PDO’er er med succes blevet genereret fra en række menneskelige tumorer til at generobre arkitekturen og funktionen af tumorvæv præcist og effektivt. Men, PDO’er er uegnede til en in vitro high-throughput assay system (HTS) eller celle analyse ved hjælp af 96-brønd eller 384-brønd plader, når de vurderer anticancer narkotika, fordi de er heterogene i størrelse og danne store klynger i kultur. Disse kulturer og analyser bruger ekstracellulære matricer, såsom Matrigel, til at skabe tumorvæv stilladser. Derfor har PDO’er en lav gennemløb og høje omkostninger, og det har været vanskeligt at udvikle et passende analysesystem. For at løse dette problem blev der etableret en enklere og mere præcis HTS ved hjælp af PDO’er til at evaluere styrken af anticancermedicin og immunterapi. En in vitro HTS blev oprettet, der bruger BOB’er etableret fra solide tumorer kultiveret i 384-brønd plader. Der blev også udviklet en HTS til vurdering af antistofafhængig cellulær cytotoksicitetsaktivitet for at repræsentere immunresponset ved hjælp af PDO’er, der dyrkes i 96-brøndsplader.
Human cancer cellelinjer er almindeligt accepteret til at studere biologi kræft og evaluere kræftmidler. Men disse cellelinjer ikke nødvendigvis bevare de oprindelige karakteristika for deres kildevæv, fordi deres morfologi, genmutation, og genekspression profil kan ændre sig under kultur over lange perioder. Desuden dyrkes de fleste af disse cellelinjer i et monolag eller bruges som murin xenografts, hvoraf ingen fysisk repræsenterer tumorvæv1,2. Således kan den kliniske effekt af kræftmidler ikke være den samme som den, der observeres i kræftcellelinjer. Derfor er der udviklet in vitro-systemer, såsom ex vivo-analyser ved hjælp af patientafledte tumor-xenografts eller patient-afledte tumororganoider (PDO’er) og tumorspheroidmodeller, der nøjagtigt gengiver tumorvævets struktur og funktion. Stigende evidens tyder på, at disse modeller forudsiger patienternes reaktion på kræftmidler ved at være direkte sammenlignelige med det tilsvarende kræftvæv. Disse in vitro-systemer er blevet etableret for forskellige tumorvævstyper, og tilknyttede high-throughput assay systemer (HTS) til lægemiddelscreening er også blevet udviklet3,4,5,6,7. Heterogene ex vivo organoid kulturer af primære tumorer fremstillet af patienter eller patient-afledt tumor xenografts har fået betydelig trækkraft i de seneste år på grund af deres lethed af kultur og evne til at opretholde kompleksiteten af celler i stromal væv8,9,10. Disse modeller forventes at øge forståelsen af kræftens biologi og lette evalueringen af lægemiddeleffektivitet in vitro.
En række nye BOB’er blev for nylig skabt fra forskellige typer tumorvæv, udpeget som F-BOB, under Fukushima Translational Research Project. PDO’erne danner store celleklynger med en morfologi svarende til kildetumoren og kan dyrkes i mere end seks måneder11. Den komparative histologi og omfattende genekspression analyser viste, at funktionerne i PDO’er er tæt på dem af deres kilde tumorvæv, selv efter langvarig vækst under kulturforhold. Desuden blev der etableret en passende HTS for hver type BOB i 96-brønd og 384-brønd plader. Disse analyser blev brugt til at evaluere flere molekylære målrettede stoffer og antistoffer. Her blev standard kemoterapi (paclitaxel og carboplatin), der anvendes til endometriecancer, evalueret ved hjælp af F-PDO’er, der stammer fra en patient, der ikke reagerede på paclitaxel og carboplatin. Derfor var den cellevækst hæmmende aktivitet af paclitaxel og carboplatin mod denne BOB svag (IC50: >10 μM). Derudover har tidligere forskning rapporteret, at nogle F-BOB’ers følsomhed over for kemoterapeutiske agenser og molekylære målrettede midler er i overensstemmelse med den kliniske effekt11,12,13. Endelig blev ændringer i den højere ordensstruktur af PDF-filer forårsaget af kræftmidler analyseret ved hjælp af et tredimensionelt celleanalysesystem12,13. Resultaterne af evalueringen af kræftmidler ved hjælp af en BOB-baseret HTS kan sammenlignes med de kliniske resultater, der er opnået for disse stoffer. Her præsenteres en protokol for en enklere og mere præcis HTS, der kan bruges til at evaluere styrken af anticancermidler og immunterapi ved hjælp af BOB-modellerne.
Det unikke ved BOB’er er, at de ikke er enzymatisk adskilt i enkelte celler under kultur eller analyse og opretholder celleklynger i kultur. Derfor kan antallet af celler ikke tælles nøjagtigt under et mikroskop. For at løse dette problem bestemmes antallet af celler visuelt ved at fore et centrifugerør, der indeholder cellerne med rør markeret med niveauer for 50-200 μL (Figur 1B). Desuden, fordi det er vanskeligt at måle pellet volumen af celle klynger dyrkes i en 25 cm2 kolbe visuelt, tidspunktet for passagen blev bestemt ved hjælp af medium farveændring fra rød til gul og den mærkbare stigning i enkeltceller eller vragrestercompareret med tidspunktet for passaging som indikatorer (Figur 1A, C). Dette er pointen med passaging for BOB’er. Mængden af BOB pellets måles visuelt efter centrifugering ved hver medium ændring. Når pelletvolumenet holder op med at stige, og mediet bliver gult dagen efter medium udskiftning, anses mediet for at være mættet med densitet, og der udføres passaging. Pelletvolumen defineres for hver BOB. Hvis PDO’erne ikke formerer sig, ændres mængden af medium fra 80% til 50% på tidspunktet for medium udveksling, og tætheden af BOB’er øges i kulturen.
Der blev udviklet en HTS, der er egnet til BOB’er. Dens gennemløb er mindst ti til tyve 384-brønd plader udført ved hjælp af en 75 cm2 kolbe BOB, og antallet af plader forarbejdet om dagen er mindst 50. Desuden er resultaterne af HTS’s evaluering af forskellige kræftlægemidler ved hjælp af BOB’er allerede blevet rapporteret.
Ved udførelse af HTS behandles tilstopning af maskefilteret forårsaget af mincing af F-BOB’erne ved hjælp af cellefragmenterings- og spredningsudstyret i første omgang ved at ændre filterets maskestørrelse til 100 μm. Det næste skridt er at reducere mængden af BOB-suspensionen, der påføres glasbeholderen. Ved tilberedning af teststofopløsninger til HTS opløses lavdybtryksforbindelser normalt i dimethylsulfoxid, og antistofferne opløses i fosfatbufferet saltvand. Det relevante opløsningsmiddel anvendes som teststof, og kontroldataene indhentes fra det anvendte opløsningsmiddel.
Følgende er en beskrivelse af, hvordan man skal håndtere variabilitet i analysedataene. Hvis der er stor variation i dataene i testen ved hjælp af 384-brøndsplader, skal analysepladen ændres til et 96-brønds pladeformat. PDO fortyndingsfaktoren (antal såede celleklynger) undersøges også efter såning af pladen. Endelig kan cellepluknings- og billedbehandlingssystemet bruges til at vælge størrelsen af PDO’er til analysen. Før du føjer PDO’er til kammeret, skal enkelte celler og små celleklynger fjernes ved centrifugering ved lav hastighed for at kunne genkende PDO’er korrekt. Hvis enkelte celler eller små celleklynger er synlige, efter at der er føjet PDO’er til kammeret, kan der udføres flere dispersioner for at fjerne de enkelte celler. Dernæst, selvom cellepluknings- og billeddannelsessystemet har en funktion, der gør det muligt at holde pladen varm, bruges denne funktion ikke på grund af fordampningen af kulturmediet, når systemet arbejder i lang tid. Endelig er mængden af celleklynger ukendt, fordi den genkendes af et planarbillede. Hvis to eller flere BOB’er overlapper hinanden, kan en enkelt BOB desuden ikke genkendes korrekt. Det er dog muligt at fjerne uønskede PDF-filer ved hjælp af fjernfunktionen ved at kontrollere dem på det scannede billede efter flytningen.
Den elektriske impedans måleinstrument er generelt anvendes til klæbende mål kræftceller til at overvåge ændringer i impedans under cellespredning. Derfor registreres der ikke en ændring i celleindekset for ikke-klæbende PDF-filer. I et forsøg på at løse dette problem er det nødvendigt at undersøge såningsbetingelserne såsom BOB-tæthedsgrad og enzymatisk behandling (celle dissociationenzym og behandlingstid) afhængigt af typen af BOB. Brøndene i pladen skal også være belagt med en passende ekstracellulær matrix til såning af PDO’er. PDO’er er seedet uden enzymatisk behandling, afhængigt af typen af BOB. RLUN007 blev brugt til at måle impedansen ved at så BOB’erne på en 96-brønds plade efter at have spredt dem ved enzymatisk behandling. RLUN007 blev behandlet med cellekulturens dissociationsreagens i 20 min ved 37 °C for at sprede cellerne og fastgøre dem til brøndene på en 96-brønds plade. I betragtning af at dissocierede RLUN007-celler straks danner aggregater, er det ønskeligt at frø på pladerne lige efter filtrering ved hjælp af en si. Efter at have overført celleaffjedringen fra røret til et reservoir blev reservoiret forsigtigt flyttet fra højre til venstre to til tre gange og pipetted op og ned fem gange før såning på pladen. Suspensionen blev også blandet med hver tilføjelse til brønden. Pladen blev derefter placeret i et biologisk sikkerhedsskab i 30 min (til BOB’ er) eller 15 min (for NK-celler) for at give cellerne mulighed for at fordele jævnt i brønden. Det andet vigtige punkt er, at behandling med antistoffer og NK-celler skal tideres til at forekomme, før celleindekset når et plateau, og værdien ikke er mindre end 0,5. I tilfælde af RLUN007 er det optimale tidspunkt at starte analysen 20-22 timer efter plating, og cellenummeret til såning er 5 x 104 celler / brønd.
Generelt bruger kulturen og analyserne for tumororganoider ekstracellulære matricer som Matrigel til at skabe tumorvævsstillad eller enzymer som trypsin og kollagenase for at forstyrre organoiderne3,4,5,6,7. Fordelen ved denne metode er, at der ikke kræves ekstracellulær matrix eller enzymatisk behandling under kultur og analyse (bortset fra analyser ved hjælp af det elektriske impedansmålerinstrument), hvilket reducerer arbejdsbehov og omkostninger betydeligt. Desuden er denne metode relativt let at tilpasse sig HTS-analysesystemer og forskellige målesystemer. Men brugen af en ekstracellulær matrix er ønskeligt for nogle forskningsformål, fordi det kan fungere som et stillads for celler og påvirke morfogenese, differentiering, og homøostase i væv.
I denne undersøgelse blev BOB’er (RLUN007) med en EGFR-mutation (L858R), der er klinisk følsomme over for EGFR-hæmmere og højt udtryk for EGFR-genet (ikke vist data) anvendt til at evaluere EGFR-hæmmere. Det blev påvist, at RLUN007’s følsomhed over for EGFR-hæmmere var højere end hos andre lungekræft-afledte F-PDO’er13 (figur 4). Således er en HTS ved hjælp af PDO’er, som bevarer tumorvævets egenskaber, overlegen til evaluering af potentielle kræftmidler og giver muligheder for lægemiddelvurdering og fremskridt inden for personlig medicin. Selvom HTS er egnet til den indledende screening af midler, reproducerer det ikke tumormikromiljøet og kan derfor ikke evaluere effekten af lægemidler in vivo. Derfor er et in vitro-system, der kan efterligne human tumorvæv in vivo ved co-kultur med vaskulære endotelceller og andre stromale celler eller organ-on-a-chip-teknologi i mangel af dyremodeller, nu under udvikling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke de patienter, der leverede de kliniske prøver, der anvendes i denne forskning. Denne forskning er støttet af tilskud fra Translational Research Program af Fukushima Prefecture.
384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate | Corning | 4516 | Plates for HTS |
40-µm Cell Strainer | Corning | 352340 | |
AdoptCell-NK kit | Kohjin Bio | 16030400 | Kit for NK cell production |
Cancer Cell Expansion Media plus | Fujifilm Wako Pure Chemical | 032-25745 | Medium for F-PDO |
ALyS505N-175 | Cell Science & Technology institute | 10217P10 | Medium for NK cells |
CELL HANDLER | Yamaha Motor | – | Cell picking and imaging system |
CellPet FT | JTEC | – | Cell fragmentation and dispersion equipment |
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9683 | Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent |
Echo 555 | Labcyte | – | Liquid handler |
EnSpire | PerkinElmer | – | Plate reader |
E-plate VIEW 96 | Agilent | 300601020 | Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System |
Fibronectin Solution | Fujifilm Wako Pure Chemical | 063-05591 | Plate coating for xCELLigence RTCA System |
F-PDO | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | – | The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International |
Morphit software, version 6.0 | The Edge Software Consultancy | Biological data analysis software | |
Multidrop Combi | ThermoFisher Scientific | 5840300 | Cell suspension dispenser |
Precision Chamber | Yamaha Motor | JLE9M65W230 | Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER |
Precision Tip | Yamaha Motor | JLE9M65W300 | Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER |
RLUN007 | Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International | Lung tumor derived F-PDO | |
TrypLE Express | ThermoFisher Scientific | 12604021 | Cell culture dissociation reagent |
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask | Corning | 4616 | Culture flask for PDO |
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask | Corning | 3814 | Culture flask for PDO |
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System | Beckman coulter | – | Cell viability analyzer |
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 | ACEA Bioscience | – | Analysis software for xCELLigence RTCA System |
xCELLigence RTCA System | ACEA Bioscience | – | Electrical impedance measuring instrument for cytolysis |