Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

Matthew J. Gaffrey; Nicholas J. Day; Xiaolu Li; Wei-Jun Qian

doi:10.3791/62671

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Article de méthode

Capture assistée par résine couplée à un étiquetage de masse en tandem isobare pour la quantification multiplexée de l’oxydation des protéines thiols

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DOI :

10.3791/62671

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21 juin 2021

Matthew J. Gaffrey¹ , Nicholas J. Day¹ , Xiaolu Li² , Wei-Jun Qian¹

¹Integrative Omics, Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, ²Bioproducts Sciences and Engineering Laboratory, Department of Biological Systems Engineering, Washington State University

Dans cet article

Résumé

L’oxydation des protéines thiols a des implications significatives dans des conditions physiologiques et physiopathologiques normales. Nous décrivons les détails d’une méthode quantitative de protéomique redox, qui utilise la capture assistée par résine, le marquage isobare et la spectrométrie de masse, permettant l’identification et la quantification spécifiques au site des résidus de cystéine oxydés de protéines de manière réversible.

Résumé

Les modifications oxydatives réversibles sur les thiols protéiques sont récemment apparues comme des médiateurs importants de la fonction cellulaire. Nous décrivons ici la procédure détaillée d’une méthode quantitative de protéomique redox qui utilise la capture assistée par résine (RAC) en combinaison avec le marquage isobare par étiquette de masse en tandem (TMT) et la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS / MS) pour permettre la quantification stochiométrique multiplexée des thiols de protéines oxydées au niveau du protéome. Les informations quantitatives spécifiques au site sur les résidus oxydés de cystéine fournissent des informations supplémentaires sur les impacts fonctionnels de ces modifications.

Le flux de travail est adaptable à de nombreux types d’échantillons, y compris les cellules en culture (par exemple, mammifères, procaryotes) et les tissus entiers (par exemple, le cœur, les poumons, les muscles), qui sont initialement lysés / homogénéisés et avec des thiols libres alkylés pour empêcher l’oxydation artificielle. Les thiols de protéines oxydées sont ensuite réduits et capturés par une résine d’affinité thiol, qui rationalise et simplifie les étapes du flux de travail en permettant aux procédures de digestion, d’étiquetage et de lavage d’être effectuées sans transfert supplémentaire de protéines / peptides. Enfin, les peptides marqués sont élués et analysés par LC-MS/MS pour révéler des changements stœchiométriques complets liés à l’oxydation du thiol sur l’ensemble du protéome. Cette méthode améliore considérablement la compréhension du rôle de la régulation redox-dépendante dans les états physiologiques et physiopathologiques liés à l’oxydation des protéines thiol.

Introduction

Dans des conditions homéostatiques, les cellules génèrent des espèces réactives d’oxygène, d’azote ou de soufre qui aident à faciliter les processus, tels que le métabolisme et la signalisation ^1,2,3^, s’étendant à la fois aux procaryotes et aux eucaryotes. Les niveaux physiologiques de ces espèces réactives sont nécessaires au bon fonctionnement cellulaire, également connu sous le nom d'«eustress»^1,4. En revanche, une augmentation des oxydants qui entraîne un déséquilibre entre les oxydants et les antioxydants peut pr....