Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

Summary

Présenté ici est un protocole pour une approche d’échange hydrogène/deutérium (HDX) basée sur l’électrophorèse capillaire couplée à une spectrométrie de masse descendante. Cette approche caractérise la différence dans les structures d’ordre supérieur entre différentes espèces de protéines, y compris les protéines dans différents états et différentes protéoformes, en effectuant une séparation différentielle simultanée HDX et électrophorétique.

Abstract

La résolution de l’hétérogénéité conformationnelle de plusieurs états protéiques qui coexistent en solution reste l’un des principaux obstacles à la caractérisation des thérapies protéiques et à la détermination des voies de transition conformationnelle essentielles aux fonctions biologiques, allant de la reconnaissance moléculaire à la catalyse enzymatique. La réaction d’échange hydrogène/deutérium (HDX) couplée à une analyse par spectrométrie de masse (MS) descendante fournit un moyen de caractériser les structures et la dynamique d’ordre supérieur des protéines d’une manière spécifique au conformateur. Le pouvoir de résolution conformationnelle de cette technique dépend fortement de l’efficacité de la séparation des états protéiques au niveau des protéines intactes et de la minimisation de la teneur protique résiduelle non deutérée pendant les réactions HDX.

Nous décrivons ici une variante basée sur l’électrophorèse capillaire (CE) de l’approche HDX MS qui vise à améliorer la résolution conformationnelle. Dans cette approche, les protéines subissent des réactions HDX tout en migrant à travers une solution d’électrolyte de fond deutérée (BGE) pendant la séparation électrophorétique capillaire. Différents états protéiques ou protéoformes qui coexistent en solution peuvent être séparés efficacement en fonction de leurs différents rapports charge/taille. La différence de mobilité électrophorétique entre les protéines et les molécules de solvant protique minimise le solvant résiduel non deutéré, ce qui entraîne un environnement de deutération presque complet pendant le processus HDX. L’interface microviale CE-MS à écoulement permet une ionisation par électropulvérisation efficace des espèces protéiques éluées après un mélange rapide avec la solution modificateur de trempe et de dénaturation à la sortie du pulvérisateur. L’analyse descendante en ligne de la SEP mesure le niveau global de deutération des espèces protéiques intactes éluées et, par la suite, la deutération de leurs fragments en phase gazeuse. Cet article démontre cette approche dans le HDX différentiel pour les systèmes, y compris les variantes protéiques naturelles coexistant dans le lait.

Introduction

Il est important de distinguer les espèces protéiques dans différents états conformationnels, de liaison ou de modification et de caractériser leurs différences structurelles pour surveiller les voies de transition entre ces espèces impliquées dans des événements biologiques, allant de la reconnaissance moléculaire à la catalyse enzymatique, et comprendre les mécanismes sous-jacents à ces événements. Les techniques biophysiques conventionnelles ne fournissent pas une solution complète en raison des limites telles que la résolution insuffisante et la perte d’informations dynamiques dans la solution. L’échange hydrogène/deutérium couplé à la spectrométrie de masse (HDX MS) est une technique qui marque les caractéristiques structurelles et conformationnelles des protéines avec le deutérium (²H) via l’échange entre les atomes d’hydrogène labile des protéines et ²H de la solution ²H_2Odélibérément introduite. Les protons impliqués dans la liaison hydrogène ou qui sont séquestrés du solvant à l’intérieur de la protéine ne s’échangent pas facilement¹. Ainsi, comme le taux de change sur un site échangeable dépend fortement de son implication dans des structures d’ordre supérieur, les structures protéiques peuvent être révélées à haute résolution spatiale par MS qui sonde l’étendue et le taux d’absorption de ²H en fonction des différentes masses atomiques entre ¹H et ²H. Au cours des dernières décennies, HDX MS est devenu une technique remarquablement réussie pour étudier les conformations et la dynamique des protéines².

Dans l’approche ascendante classique de HDX MS, l’ensemble des espèces protéiques dans différents états de conformation, de liaison ou de modification est protéolysé sans séparation au niveau des protéines intactes, ce qui rend impossible de caractériser des espèces individuelles en analysant les fragments protéolytiques résultants avec des teneurs en deutérium alambiquées. En revanche, dans l’approche descendante, différents états protéiques ou protéoformes qui ont incorporé différentes teneurs en deutérium donnent lieu à de multiples distributions de masses protéiques intactes dans un scan MS. Cela permet de séparer les espèces individuelles par la sélection de masse d’ions correspondant à chaque distribution de masse à l’aide d’un filtre de masse approprié (tel qu’un quadripolaire) et la caractérisation de leurs différences conformationnelles dans l’analyse ultérieure en tandem MS 3,4,5,6. Cependant, l’efficacité de la séparation des états protéiques ou des protéoformes dans cette stratégie est limitée par l’ampleur de la différence dans leurs distributions de masse correspondantes.

L’électrophorèse capillaire (EC) fournit un moyen de séparer les espèces de protéines en fonction de leurs différentes charges et tailles hydrodynamiques dans la phase de solution avec une efficacité élevée⁷. La combinaison de CE avec HDX offre une séparation supplémentaire des états protéiques ou protéoformes dans la phase de solution. De plus, le petit volume du capillaire CE permet l’utilisation d’une solution entièrement deutérée comme solution d’électrolyte de fond (BGE), c’est-à-dire le tampon de fonctionnement, rendant le capillaire comme un réacteur HDX pour les échantillons de protéines. En raison de la différence de mobilité électrophorétique entre les protéines et les réactifs protiques dans le processus d’électrophorèse, la conduite de HDX pendant l’EC entraîne un environnement de deutération presque complet pour les analytes protéiques avec un contenu résiduel non deutéré minimal, améliorant ainsi la sensibilité de l’analyse structurelle à l’aide de données HDX. En tant que tel, nous avons développé une approche HDX différentielle basée sur CE couplée à une SEP descendante pour caractériser les structures d’ordre supérieur des protéines d’une manière spécifique à l’état ou à la protéoforme⁸.

Cet article décrit les protocoles de cette approche en détaillant les étapes de la préparation du matériel, de la procédure expérimentale et de l’analyse des données. Les facteurs susceptibles d’affecter les performances de la méthode ou la qualité des données sont énumérés dans de brèves notes. Les résultats représentatifs présentés ici comprennent des données HDX différentielles sur les mélanges de différentes protéines et variantes naturelles de la β-lactoglobuline bovine (β-lg), la principale protéine de lactosérum présente dans le lait⁹. Nous démontrons l’efficacité de séparation, la reproductibilité et les performances d’étiquetage ²H des deux variantes abondantes de β-lg, c’est-à-dire A et B^10,11 lors du HDX basé sur CE et de la caractérisation spécifique à la variante de leurs conformations.

Protocol

REMARQUE : Utilisez des réactifs de qualité chromatographique liquide à haute performance (CLHP) ou de qualité MS dans la mesure du possible afin de minimiser les contaminants susceptibles d’interférer avec l’analyse de la SEP. Ne touchez pas l’interface CE-MS à mains nues pendant la mesure pour éviter la possibilité d’un choc électrique causé par la tension électrophorétique ou la tension d’électropulvérisation. 1. Préparation du matériel Modification du ca…

Representative Results

La modification de la pression de perfusion de BGE permet d’ajuster à la fois l’efficacité de séparation et le temps de migration, ce qui équivaut au temps de réaction HDX des protéines à séparer (Figure 3). Une pression de perfusion plus faible se traduit par une meilleure séparation des pics CE au détriment de la durée de l’expérience (Figure 3A). Un temps de migration/réaction HDX plus long entraîne un niveau plus élevé de deutération d…

Discussion

Les objectifs du revêtement de la paroi interne du capillaire CE comprennent la minimisation du flux électroosmotique et l’absorption des protéines au cours du processus CE¹³. Bien que l’écoulement électroosmotique soit bénéfique pour l’analyse CE conventionnelle de petites molécules en raison de sa capacité à conduire des espèces neutres ou chargées de manière opposée au détecteur, il compromet l’efficacité de séparation des espèces de protéines de tailles et de charges…

Materials

ammonium acetate	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system	Sciex, USA
centrifuge	Eppendorf	5406000097
centrifugal filter	Merck	UFC201024	10 kDa cutoff
deuterium oxide	Energy Chemical	E090001	99.9 % D
formic acid	Acros Organics	270480250
fused silica glass capillary	Polymicro Technologies	1068150017	ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography	Agilent	GC6890N
hydrochloric acid	Sigma Aldrich	258148
hydroxypropyl cellulose	Aladdin	H113415	MW 100000
magnetic stirrers	DLAB	8030101212
methanol	Fisher Chemical	A456-4	MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer	DeNovix	84677JK7731
myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System	Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
ubiquitin	Sigma Aldrich	U6253
ultrasonicator	SCIENTZ	SB-5200
β-lactoglobulin	Sigma Aldrich	L0130