חילופי מימן/דיטריום מבוססי נימי אלקטרופורזה לאפיון קונפורמציה של חלבונים עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה
Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול עבור אלקטרופורזה מבוססת אלקטרופורזה נימית מימן / דיוטריום חילופי (HDX) גישה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה מלמעלה למטה. גישה זו מאפיינת את ההבדל במבנים מסדר גבוה יותר בין מיני חלבונים שונים, כולל חלבונים במצבים שונים ופרוטאופורמים שונים, על ידי ביצוע HDX דיפרנציאלי בו זמנית והפרדה אלקטרופורטית.
Abstract
פתרון הטרוגניות קונפורמציה של מצבי חלבון מרובים המתקיימים יחד בתמיסה נותר אחד המכשולים העיקריים באפיון של טיפולי חלבון וקביעת מסלולי המעבר הקונפורמציה הקריטיים לפונקציות ביולוגיות, החל מזיהוי מולקולרי ועד קטליזה אנזימטית. תגובת חילופי מימן/דיטריום (HDX) בשילוב עם ניתוח ספקטרומטרי מסה מלמעלה למטה (MS) מספקים אמצעי לאפיון מבנים ודינמיקה של חלבונים בסדר גבוה יותר באופן ספציפי לקונפורמיסט. כוח פתרון הקונפורמציה של טכניקה זו תלוי מאוד ביעילות של הפרדת מצבי חלבון ברמת החלבון בשלמותה ולמזעור שאריות התוכן הפרוטי שאינו מתויג במהלך תגובות ה-HDX.
כאן אנו מתארים גרסה מבוססת אלקטרופורזה נימית (CE) של גישת HDX MS שמטרתה לשפר את הרזולוציה הקונפורמציה. בגישה זו, חלבונים עוברים תגובות HDX תוך כדי נדידה דרך פתרון אלקטרוליטי רקע deuteated (BGE) במהלך ההפרדה האלקטרופורטית הנימית. מצבי חלבון או פרוטאופורמים שונים הקיימים בתמיסה ניתנים להפרדה יעילה בהתבסס על יחסי הטעינה-לגודל השונים שלהם. ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים ומולקולות ממס פרוטיות ממזער את הממס השיורי שאינו מוערך, וכתוצאה מכך סביבת deuterating כמעט מלאה במהלך תהליך HDX. ממשק CE-MS המיקרוביאלי המיקרוביאלי מאפשר יינון אלקטרו-ספריי יעיל של מיני החלבון המנופחים לאחר ערבוב מהיר עם תמיסת המכפיל המרווה והדנטורינג בשקע המרסס. ניתוח הטרשת הנפוצה המקוון מלמעלה למטה מודד את רמת ההפחתה העולמית של מיני החלבון השלמים, ולאחר מכן, את ההפחתה של שברי שלב הגז שלהם. מאמר זה מדגים גישה זו ב-HDX דיפרנציאלי למערכות, כולל גרסאות החלבון הטבעיות הקיימות בחלב.
Introduction
הבחנה בין מיני חלבונים במצבים קונפורמצונליים, מחייבים או משתנים שונים ואפיון ההבדלים המבניים שלהם חשובים לניטור מסלולי המעברים בין מינים אלה המעורבים באירועים ביולוגיים, החל מהכרה מולקולרית ועד קטליזה אנזימטית, והבנת המנגנונים העומדים בבסיס אירועים אלה. טכניקות ביופיסיות קונבנציונליות אינן מספקות פתרון מלא בשל מגבלות כגון רזולוציה לא מספקת ואובדן מידע דינמי בפתרון. חילופי מימן/דיאוטריום בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (HDX MS) היא טכניקה המתייגת את התכונות המבניות והקונפורמציה של חלבונים עם דיטריום (2H) באמצעות חילופים בין אטומי מימן שפתיים של חלבונים ו -2H מפתרון 2H2O שהוצג במכוון. פרוטונים המעורבים מליטה מימן או כי הם מבודדים מן הממס בפנים החלבון אינם מחליפים בקלות1. לפיכך, מכיוון ששער החליפין באתר הניתן להחלפה תלוי מאוד במעורבותו במבנים מסדר גבוה יותר, ניתן לחשוף את מבני החלבון ברזולוציה מרחבית גבוהה על ידי טרשת נפוצה הבוחנת את היקף וקצב ספיגת H של 2H בהתבסס על המסות האטומיות השונות בין 1H ל – 2H. במהלך העשורים האחרונים, HDX MS הפך לטכניקה מוצלחת להפליא לחקר קונפורמציות חלבון ודינמיקה2.
בגישה הקלאסית מלמטה למעלה של HDX MS, ההרכב של מינים חלבון במצבים קונפורמציה, מחייבים או שינוי שונים הוא proteolyzed ללא הפרדה ברמת החלבון שלם, מה שהופך אותו בלתי אפשרי לאפיין מינים בודדים על ידי ניתוח שברים פרוטאוליטיים וכתוצאה מכך עם תוכן deuterium מפותל. לעומת זאת, בגישה מלמעלה למטה, מצבי חלבון שונים או פרוטאופורמים ששילבו תוכן דיטריום שונה מעוררים הפצות מרובות של גושי חלבון שלמים בסריקת MS. זה מאפשר מינים בודדים להיות מופרדים על ידי בחירה המונית של יונים המתאימים לכל התפלגות מסה באמצעות מסנן מסה מתאים (כגון quadrupole) ואת האפיון של ההבדלים הקונפורמציה שלהם בניתוח MS הדו-מושבי הבא 3,4,5,6. עם זאת, היעילות של הפרדת מצבי חלבון או פרוטאופורמים באסטרטגיה זו מוגבלת על ידי מידת ההבדל בהפצות המסה המתאימות שלהם.
אלקטרופורזה נימית (CE) מספקת אמצעי להפרדת מיני חלבונים בהתבסס על המטענים השונים שלהם וגדלים הידרודינמיים בשלב הפתרון ביעילות גבוהה7. שילוב CE עם HDX מציע הפרדה נוספת של מצבי חלבון או פרוטאופורמים בשלב הפתרון. בנוסף, הנפח הקטן של נימי CE מאפשר ניצול של פתרון deuterated לחלוטין כמו פתרון אלקטרוליטים רקע (BGE), כלומר, חיץ פועל, עיבוד הנימים ככור HDX עבור דגימות חלבון. בשל ההבדל בניידות אלקטרופורטית בין חלבונים לבין ריאגנטים פרוטיים בתהליך האלקטרופורזה, ביצוע HDX במהלך CE גורם לסביבת deuterating כמעט מלאה עבור מנתחי חלבון עם תוכן שיורית מינימלית ללא deuteated, ובכך לשפר את הרגישות של הניתוח המבני באמצעות נתוני HDX. ככזה, פיתחנו גישת HDX דיפרנציאלית מבוססת CE בשילוב עם טרשת נפוצה מלמעלה למטה כדי לאפיין מבנים מסוג חלבון בסדר גבוה יותר באופן ספציפי למצב או פרוטאופורם8.
מאמר זה מתאר פרוטוקולים לגישה זו על-ידי פירוט שלבי הכנת החומרים, ההליך הניסיוני וניתוח הנתונים. גורמים שעשויים להשפיע על ביצועי השיטה או על איכות הנתונים מפורטים בהערות קצרות. התוצאות הייצוגיות המוצגות כאן כוללות נתוני HDX דיפרנציאליים של תערובות של חלבונים שונים ווריאנטים טבעיים של β-לקטוגלובולין בקר (β-lg), חלבון מי הגבינה העיקרי הנמצא בחלב9. אנו מדגימים יעילות הפרדה, רבייה וביצועי תיוג H של 2גרסאות שופעות של β-lg, כלומר, A ו- B10,11 במהלך HDX מבוסס CE ואפיון ספציפי לגרסה של הקונפורמציות שלהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרות של ציפוי הקיר הפנימי של נימי CE כוללות את מזעור הזרימה האלקטרו-קוסמוטית וספיגת החלבון במהלך תהליך CE13. למרות שזרימה אלקטרוסמוטית מועילה לניתוח CE קונבנציונלי של מולקולות קטנות בשל יכולתה להניע מינים ניטרליים או טעונים הפוך לגלאי, היא פוגעת ביעילות ההפרדה של מינים חלבוני…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (NSFC 21974069). המחברים קיבלו גם תמיכה מהמכון לניתוח תאים, מעבדת מפרץ שנזן, סין; מרכז החדשנות השיתופית של ג’יאנגסו לחומרים פונקציונליים ביו-רפואיים; והמעבדה העיקרית של ג’יאנגסו לחומרים ביו-רפואיים באוניברסיטת נאנג’ינג נורמל, סין.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochimie. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochimie. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
