केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज टॉप-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए
Summary
यहां प्रस्तुत एक केशिका वैद्युतकणसंचलन-आधारित हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज (एचडीएक्स) दृष्टिकोण के लिए एक प्रोटोकॉल है जो शीर्ष-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ युग्मित है। यह दृष्टिकोण विभिन्न प्रोटीन प्रजातियों के बीच उच्च-क्रम संरचनाओं में अंतर की विशेषता है, जिसमें विभिन्न राज्यों में प्रोटीन और विभिन्न प्रोटियोफॉर्म शामिल हैं, समवर्ती विभेदक एचडीएक्स और इलेक्ट्रोफोरेटिक अलगाव का संचालन करके।
Abstract
समाधान में सह-अस्तित्व वाले कई प्रोटीन राज्यों की संरचनात्मक विषमता को हल करना प्रोटीन चिकित्सीय के लक्षण वर्णन में मुख्य बाधाओं में से एक है और जैविक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण संरचनात्मक संक्रमण मार्गों का निर्धारण, आणविक मान्यता से लेकर एंजाइमेटिक कटैलिसिस तक। हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज (एचडीएक्स) प्रतिक्रिया शीर्ष-डाउन मास स्पेक्ट्रोमेट्रिक (एमएस) विश्लेषण के साथ मिलकर प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनाओं और गतिशीलता को एक संरूपक-विशिष्ट तरीके से चिह्नित करने का एक साधन प्रदान करती है। इस तकनीक की संरचनात्मक समाधान शक्ति बरकरार प्रोटीन स्तर पर प्रोटीन राज्यों को अलग करने और एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं के दौरान अवशिष्ट गैर-ड्यूटेरेटेड प्रोटिक सामग्री को कम करने की क्षमता पर अत्यधिक निर्भर करती है।
यहां हम एचडीएक्स एमएस दृष्टिकोण के एक केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) -आधारित संस्करण का वर्णन करते हैं जिसका उद्देश्य संरचनात्मक संकल्प में सुधार करना है। इस दृष्टिकोण में, केशिका इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण के दौरान एक ड्यूटेरेटेड पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान (बीजीई) के माध्यम से माइग्रेट करते समय प्रोटीन एचडीएक्स प्रतिक्रियाओं से गुजरते हैं। विभिन्न प्रोटीन राज्यों या proteoforms कि समाधान में सह-अस्तित्व में उनके अलग चार्ज-टू-आकार अनुपात के आधार पर कुशलतापूर्वक अलग किया जा सकता है। प्रोटीन और प्रोटिक विलायक अणुओं के बीच इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता में अंतर अवशिष्ट गैर-ड्यूटेरेटेड विलायक को कम करता है, जिसके परिणामस्वरूप एचडीएक्स प्रक्रिया के दौरान लगभग पूर्ण deuterating वातावरण होता है। प्रवाह के माध्यम से माइक्रोवियल सीई-एमएस इंटरफ़ेस स्प्रेयर के आउटलेट पर शमन और विकृत संशोधक समाधान के साथ तेजी से मिश्रण के बाद एल्यूटेड प्रोटीन प्रजातियों के कुशल इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण की अनुमति देता है। ऑनलाइन टॉप-डाउन एमएस विश्लेषण एल्यूटेड बरकरार प्रोटीन प्रजातियों के वैश्विक ड्यूटेरेशन स्तर को मापता है, और बाद में, उनके गैस-चरण के टुकड़ों का ड्यूटेरेशन। यह पेपर सिस्टम के लिए विभेदक एचडीएक्स में इस दृष्टिकोण को दर्शाता है, जिसमें दूध में सह-अस्तित्व वाले प्राकृतिक प्रोटीन वेरिएंट भी शामिल हैं।
Introduction
विभिन्न संरचनात्मक, बाध्यकारी, या संशोधन राज्यों में प्रोटीन प्रजातियों को अलग करना और उनके संरचनात्मक मतभेदों की विशेषता जैविक घटनाओं में शामिल इन प्रजातियों के बीच संक्रमण के मार्गों की निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है, आणविक मान्यता से लेकर एंजाइमेटिक कटैलिसिस तक, और इन घटनाओं के अंतर्निहित तंत्र को समझना। पारंपरिक बायोफिजिकल तकनीकें अपर्याप्त संकल्प और समाधान में गतिशील जानकारी के नुकसान जैसी सीमाओं के कारण एक पूर्ण समाधान प्रदान नहीं करती हैं। हाइड्रोजन / ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एचडीएक्स एमएस) के साथ युग्मित एक तकनीक है जो प्रोटीन के लेबिल हाइड्रोजन परमाणुओं के बीच विनिमय के माध्यम से ड्यूटेरियम (2एच) के साथ प्रोटीन की संरचनात्मक और संरचनात्मक विशेषताओं को लेबल करती है और जानबूझकर पेश किए गए 2एच 2ओ समाधान से2एच। हाइड्रोजन बॉन्डिंग में शामिल प्रोटॉन या जो प्रोटीन इंटीरियर में विलायक से अलग किए जाते हैं, वे आसानी से विनिमय नहीं करते हैं1। इस प्रकार, चूंकि एक विनिमय योग्य साइट पर विनिमय दर उच्च-क्रम संरचनाओं में इसकी भागीदारी पर अत्यधिक निर्भर है, प्रोटीन संरचनाओं को एमएस द्वारा उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर प्रकट किया जा सकता है जो 1एच और 2एच के बीच अलग-अलग परमाणु द्रव्यमान के आधार पर 2 एच-अपटेक की सीमा और दरकी जांच करता है। हाल के दशकों में, एचडीएक्स एमएस प्रोटीन संरचनाओं और गतिशीलता2 का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट रूप से सफल तकनीक बन गई है।
एचडीएक्स एमएस के शास्त्रीय बॉटम-अप दृष्टिकोण में, विभिन्न संरचनात्मक, बाध्यकारी, या संशोधन राज्यों में प्रोटीन प्रजातियों की टुकड़ी को बरकरार प्रोटीन स्तर पर अलगाव के बिना प्रोटिओलाइज्ड किया जाता है, जिससे जटिल ड्यूटेरियम सामग्री के साथ परिणामी प्रोटियोलिटिक टुकड़ों का विश्लेषण करके व्यक्तिगत प्रजातियों को चिह्नित करना असंभव हो जाता है। इसके विपरीत, टॉप-डाउन दृष्टिकोण में, विभिन्न प्रोटीन राज्यों या प्रोटियोफॉर्म्स जिन्होंने विभिन्न ड्यूटेरियम सामग्री को शामिल किया है, एमएस स्कैन में बरकरार प्रोटीन द्रव्यमान के कई वितरणों को जन्म देते हैं। यह अलग-अलग प्रजातियों को एक उचित द्रव्यमान फिल्टर (जैसे एक चतुर्भुज) का उपयोग करके प्रत्येक द्रव्यमान वितरण के अनुरूप आयनों के बड़े पैमाने पर चयन और बाद के अग्रानुक्रम एमएस विश्लेषण 3,4,5,6 में उनके संरचनात्मक मतभेदों के लक्षण वर्णन द्वारा अलग करने की अनुमति देता है। हालांकि, इस रणनीति में प्रोटीन राज्यों या प्रोटियोफॉर्मों को अलग करने की दक्षता उनके संबंधित बड़े पैमाने पर वितरण में अंतर की सीमा तक सीमित है।
केशिका वैद्युतकणसंचलन (सीई) उच्च दक्षता 7 के साथ समाधान चरण में उनके अलग-अलग आवेशों और हाइड्रोडायनामिक आकारों के आधार पर प्रोटीन प्रजातियों को अलग करने का एक साधन प्रदान करताहै। एचडीएक्स के साथ सीई का संयोजन समाधान चरण में प्रोटीन राज्यों या प्रोटियोफॉर्म्स का अतिरिक्त पृथक्करण प्रदान करता है। इसके अलावा, सीई केशिका की छोटी मात्रा पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट समाधान (बीजीई) के रूप में एक पूरी तरह से deuterated समाधान के उपयोग की अनुमति देती है, यानी, चल रहे बफर, प्रोटीन नमूनों के लिए एक HDX रिएक्टर के रूप में केशिका को प्रस्तुत करते हैं। वैद्युतकणसंचलन प्रक्रिया में प्रोटीन और प्रोटिक अभिकर्मकों के बीच इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता में अंतर के कारण, सीई के दौरान एचडीएक्स का संचालन करने के परिणामस्वरूप न्यूनतम अवशिष्ट गैर-ड्यूटेरेटेड सामग्री के साथ प्रोटीन एनालिट्स के लिए लगभग पूर्ण डियूटेरेटिंग वातावरण होता है, जिससे एचडीएक्स डेटा का उपयोग करके संरचनात्मक विश्लेषण की संवेदनशीलता बढ़ जाती है। इस प्रकार, हमने एक सीई-आधारित विभेदक एचडीएक्स दृष्टिकोण विकसित किया है जो शीर्ष-डाउन एमएस के साथ मिलकर प्रोटीन उच्च-क्रम संरचनाओं को एक राज्य- या प्रोटिओफॉर्म-विशिष्ट तरीके सेचिह्नित करता है।
यह पेपर सामग्री की तैयारी, प्रयोगात्मक प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण के चरणों का विवरण देकर इस दृष्टिकोण के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। विधि प्रदर्शन या डेटा गुणवत्ता को प्रभावित कर सकने वाले कारक छोटे नोट्स में सूचीबद्ध होते हैं. यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि परिणामों में विभिन्न प्रोटीनों के मिश्रण के विभेदक एचडीएक्स डेटा और गोजातीय β-लैक्टोग्लोबुलिन (β-एलजी) के प्राकृतिक रूप शामिल हैं, जो दूध में मौजूद प्रमुख मट्ठा प्रोटीनहै। हम β-एलजी के दो प्रचुर मात्रा में रूपों के पृथक्करण दक्षता, पुनरुत्पादन, और 2एच-लेबलिंग प्रदर्शन का प्रदर्शन करते हैं, यानी, सीई-आधारित एचडीएक्स के दौरान ए और बी 10,11 और उनकी संरचनाओं के संस्करण-विशिष्ट लक्षण वर्णन।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीई केशिका की आंतरिक दीवार कोटिंग के उद्देश्यों में सीई प्रक्रिया13 के दौरान इलेक्ट्रोओस्मोटिक प्रवाह और प्रोटीन अवशोषण को कम करना शामिल है। यद्यपि इलेक्ट्रोओस्मोटिक प्रवाह डिटेक्टर के लि?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC 21974069) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। लेखकों को सेल विश्लेषण संस्थान, शेन्ज़ेन बे लैबोरेटरी, चीन से भी समर्थन मिला; Jiangsu जैव चिकित्सा कार्यात्मक सामग्री के सहयोगी नवाचार केंद्र; और नानजिंग सामान्य विश्वविद्यालय, चीन में बायोमेडिकल सामग्री की Jiangsu कुंजी प्रयोगशाला।
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochimie. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochimie. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
