トップダウン質量分析によるタンパク質の立体構造特性評価のためのキャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換
Summary
ここでは、キャピラリー電気泳動ベースの水素/重水素交換(HDX)アプローチとトップダウン質量分析を組み合わせたプロトコルを紹介します。このアプローチは、同時差動HDXおよび電気泳動分離を行うことによって、異なる状態および異なるプロテオ形態のタンパク質を含む、異なるタンパク質種間の高次構造の違いを特徴付ける。
Abstract
溶液中で共存する複数のタンパク質状態の立体構造不均一性の解決は、分子認識から酵素触媒作用に至るまで、タンパク質治療薬の特性評価および生物学的機能に重要な立体構造遷移経路の決定における主要な障害の1つであり続けている。水素/重水素交換(HDX)反応とトップダウン質量分析(MS)分析を組み合わせることで、タンパク質の高次構造とダイナミクスをコンフォーマー特異的な方法で特徴付ける手段を提供します。この技術の立体構造分解能は、インタクトなタンパク質レベルでタンパク質状態を分離し、HDX反応中に残留する非重水素化プロトン含有量を最小限に抑える効率に大きく依存します。
ここでは、立体配座分解能の向上を目的としたHDX MSアプローチのキャピラリー電気泳動(CE)ベースのバリアントについて説明します。このアプローチでは、タンパク質は、キャピラリー電気泳動分離中に重水素化バックグラウンド電解質溶液(BGE)を通って移動しながらHDX反応を受ける。溶液中に共存する異なるタンパク質状態またはプロテオフォームは、それらの異なる電荷対サイズ比に基づいて効率的に分離することができる。タンパク質とプロトン性溶媒分子との間の電気泳動移動度の差は、残留非重水素化溶媒を最小限に抑え、HDXプロセス中にほぼ完全な重水素化環境をもたらす。フロースルーマイクロバイアルCE-MSインターフェースは、噴霧器の出口で急冷および変性修飾剤溶液と迅速に混合した後、溶出タンパク質種の効率的なエレクトロスプレーイオン化を可能にする。オンラインのトップダウンMS分析は、溶出された無傷のタンパク質種の全球重水素化レベルを測定し、続いてそれらの気相断片の重水素化を測定する。このホワイトペーパーでは、牛乳中に共存する天然のタンパク質バリアントを含む、システム用の差動HDXにおけるこのアプローチを実証します。
Introduction
異なる立体構造、結合、または修飾状態のタンパク質種を区別し、それらの構造的差異を特徴付けることは、分子認識から酵素触媒作用に至るまで、生物学的事象に関与するこれらの種間の遷移経路をモニターし、これらの事象の根底にあるメカニズムを理解するために重要である。従来の生物物理学的技術は、不十分な分解能および溶液中の動的情報の損失などの制限のために、完全な解決策を提供しない。質量分析(HDX MS)と組み合わせた水素/重水素交換は、意図的に導入された2H2O溶液からのタンパク質の不安定な水素原子と2Hとの間の交換を介して、タンパク質の構造的および立体構造的特徴を重水素(2H)で標識する技術である。水素結合に関与するプロトンは、タンパク質内部で溶媒から隔離されているものや、容易に交換しない1。このように、交換可能な部位における交換速度は、その高次構造への関与に大きく依存するため、1Hと2Hの異なる原子質量に基づいて2H取り込みの程度と速度をプローブするMSによって、タンパク質構造を高い空間分解能で明らかにすることができる。ここ数十年にわたり、HDX MSはタンパク質の立体構造とダイナミクス2を研究するための卓越した技術となっています。
HDX MSの古典的なボトムアップアプローチでは、異なる立体構造、結合、または修飾状態のタンパク質種のアンサンブルは、無傷のタンパク質レベルで分離することなくタンパク質分解されるため、複雑な重水素含有量で得られたタンパク質分解断片を分析することによって個々の種を特徴付けることは不可能です。対照的に、トップダウンアプローチでは、異なる重水素含有量を組み込んだ異なるタンパク質状態またはプロテオフォームは、MSスキャンにおいて無傷のタンパク質塊の複数の分布を生じる。これにより、適切な質量フィルタ(四重極など)を用いた各質量分布に対応するイオンの質量選択と、その後のタンデムMS分析3、4、5、6におけるそれらの立体構造の違いの特性評価によって、個々の種を分離することができる。しかしながら、この戦略におけるタンパク質状態またはプロテオフォームの分離効率は、それらの対応する質量分布の違いの程度によって制限される。
キャピラリー電気泳動(CE)は、溶液相におけるそれらの異なる電荷および流体力学的サイズに基づいてタンパク質種を高効率で分離する手段を提供する7。CEとHDXを組み合わせることで、溶液相におけるタンパク質状態またはプロテオフォームのさらなる分離が可能になります。さらに、CEキャピラリーの容量が小さいため、完全に重水素化された溶液をバックグラウンド電解質溶液(BGE)、すなわちランニングバッファーとして利用でき、キャピラリーをタンパク質サンプルのHDXリアクターとしてレンダリングできます。電気泳動プロセスにおけるタンパク質とプロトン性試薬間の電気泳動移動度の違いにより、CE中にHDXを実施すると、残留非重水素化含有量が最小限に抑えられたタンパク質分析物の重水素化環境がほぼ完全になり、HDXデータを使用した構造解析の感度が向上します。そのため、CEベースの差動HDXアプローチをトップダウンMSと組み合わせて開発し、タンパク質の高次構造を状態またはプロテオフォーム特異的な方法で特徴付けました8。
このホワイトペーパーでは、材料調製、実験手順、およびデータ分析の手順を詳述することによって、このアプローチのプロトコルについて説明します。メソッドのパフォーマンスまたはデータ品質に影響を与える可能性のある要因は、短いメモにリストされています。ここで提示される代表的な結果には、乳中に存在する主要な乳清タンパク質であるウシβ-ラクトグロブリン(β-lg)の異なるタンパク質および天然変異体の混合物の差動HDXデータが含まれる9。我々は、CEベースのHDXおよびそれらの立体構造の変異体特異的特性評価中に、β-lgの2つの豊富な変異体、すなわちAおよびB10,11の分離効率、再現性、および2H標識性能を実証する。
Protocol
Representative Results
Discussion
CEキャピラリーの内壁を被覆する目的には、CEプロセス13中の電気浸透流およびタンパク質吸収の最小化が含まれる。電気浸透流は、中性または反対に荷電した種を検出器に駆動する能力のために、小分子の従来のCE分析に有益であるが、溶液中で同様のサイズおよび正味電荷を有するタンパク質種の分離効率を損なう。キャピラリーをHPCでコーティングすると、キャピラリ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(NSFC 21974069)からの助成金によって支援されました。著者らはまた、中国の深セン湾研究所の細胞分析研究所からも支援を受けた。生物医学的機能材料の江蘇省共同イノベーションセンター;南京師範大学(中国)の江蘇省生物医学材料主要研究所。
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
References
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