Kapillärelektroforesbaserat väte/deuteriumutbyte för konformationskarakterisering av proteiner med masspektrometri uppifrån och ner
Summary
Här presenteras ett protokoll för en kapillärelektroforesbaserad väte/deuteriumutbytesmetod (HDX) i kombination med masspektrometri uppifrån och ner. Detta tillvägagångssätt karakteriserar skillnaden i högre ordningsstrukturer mellan olika proteinarter, inklusive proteiner i olika tillstånd och olika proteoformer, genom att genomföra samtidig differentiell HDX och elektroforetisk separation.
Abstract
Att lösa konformationsheterogenitet av flera proteintillstånd som samexisterar i lösning är fortfarande ett av de största hindren vid karakteriseringen av proteinterapier och bestämningen av de konformationsövergångsvägar som är kritiska för biologiska funktioner, allt från molekylärt erkännande till enzymatisk katalys. Väte / deuteriumutbyte (HDX) reaktion i kombination med top-down masspektrometrisk (MS) analys ger ett sätt att karakterisera protein högre ordning strukturer och dynamik på ett konformerande specifikt sätt. Den konformationella upplösningskraften hos denna teknik är starkt beroende av effektiviteten av att separera proteintillstånd på intakt proteinnivå och minimera det återstående icke-deutererade protiska innehållet under HDX-reaktionerna.
Här beskriver vi en kapillärelektrofores (CE) -baserad variant av HDX MS-metoden som syftar till att förbättra konformationsupplösningen. I detta tillvägagångssätt genomgår proteiner HDX-reaktioner medan de migrerar genom en deutererad bakgrundselektrolytlösning (BGE) under kapillärelektroforetisk separation. Olika proteintillstånd eller proteoformer som samexisterar i lösning kan effektivt separeras baserat på deras olika laddnings-till-storlek-förhållanden. Skillnaden i elektroforetisk rörlighet mellan proteiner och protiska lösningsmedelsmolekyler minimerar det återstående icke-deutererade lösningsmedlet, vilket resulterar i en nästan fullständig deuterating miljö under HDX-processen. Det genomströmningsmikroviala CE-MS-gränssnittet möjliggör effektiv elektrosprayjonisering av de eluerade proteinarterna efter en snabb blandning med den släckande och denaturerande modifierarlösningen vid sprutans utlopp. Online-top-down MS-analysen mäter den globala deuterationsnivån för de eluerade intakta proteinarterna och därefter deuterationen av deras gasfasfragment. Detta dokument visar detta tillvägagångssätt i differentiell HDX för system, inklusive de naturliga proteinvarianterna som samexisterar i mjölk.
Introduction
Att skilja proteinarter i olika konformations-, bindnings- eller modifieringstillstånd och karakterisera deras strukturella skillnader är viktiga för att övervaka vägarna för övergångar mellan dessa arter som är involverade i biologiska händelser, allt från molekylärt erkännande till enzymatisk katalys och förstå mekanismerna bakom dessa händelser. Konventionella biofysiska tekniker ger inte en komplett lösning på grund av begränsningar som otillräcklig upplösning och förlust av dynamisk information i lösning. Väte / deuteriumutbyte i kombination med masspektrometri (HDX MS) är en teknik som märker de strukturella och konformationella egenskaperna hos proteiner med deuterium (2H) via utbytet mellan labila väteatomer av proteiner och 2H från den avsiktligt införda2H2O-lösningen. Protoner som är involverade i vätebindning eller som är sekvestrerade från lösningsmedlet i proteinets inre utbyter inte lätt1. Eftersom växelkursen på en utbytbar plats är starkt beroende av dess inblandning i strukturer av högre ordning, kan proteinstrukturerna avslöjas vid hög rumslig upplösning av MS som undersöker omfattningen och hastigheten av 2H-upptag baserat på de olika atommassorna mellan 1H och 2H. Under de senaste decennierna har HDX MS blivit en utomordentligt framgångsrik teknik för att studera proteinkonformationer och dynamik2.
I den klassiska bottom-up-metoden för HDX MS proteolyseras ensemblen av proteinarter i olika konformations-, bindnings- eller modifieringstillstånd utan separation på intakt proteinnivå, vilket gör det omöjligt att karakterisera enskilda arter genom att analysera de resulterande proteolytiska fragmenten med invecklat deuteriuminnehåll. Däremot ger olika proteintillstånd eller proteoformer som har införlivat olika deuteriuminnehåll i top-down-metoden upphov till flera fördelningar av intakta proteinmassor i en MS-skanning. Detta gör det möjligt för enskilda arter att separeras genom massselektion av joner som motsvarar varje massfördelning med användning av ett korrekt massfilter (såsom en kvadrupol) och karakteriseringen av deras konformationsskillnader i den efterföljande tandem MS-analysen 3,4,5,6. Effektiviteten av att separera proteintillstånd eller proteoformer i denna strategi begränsas emellertid av omfattningen av skillnaden i deras motsvarande massfördelningar.
Kapillärelektrofores (CE) ger ett sätt att separera proteinarter baserat på deras olika laddningar och hydrodynamiska storlekar i lösningsfasen med hög effektivitet7. Att kombinera CE med HDX erbjuder ytterligare separation av proteintillstånd eller proteoformer i lösningsfasen. Dessutom möjliggör den lilla volymen av CE-kapillären användningen av en helt deutererad lösning som bakgrundselektrolytlösning (BGE), dvs den löpande bufferten, vilket gör kapillären till en HDX-reaktor för proteinprover. På grund av skillnaden i elektroforetisk rörlighet mellan proteiner och protiska reagenser i elektroforesprocessen resulterar ledande HDX under CE i en nästan fullständig deuterating miljö för proteinanalyterna med minimalt kvarvarande icke-deutererat innehåll, vilket ökar känsligheten för strukturanalysen med hjälp av HDX-data. Som sådan utvecklade vi en CE-baserad differentiell HDX-metod i kombination med top-down MS för att karakterisera proteinstrukturer av högre ordning på ett tillstånds- eller proteoformspecifikt sätt8.
Detta dokument beskriver protokoll för detta tillvägagångssätt genom att beskriva stegen för materialberedning, experimentell procedur och dataanalys. Faktorer som kan påverka metodens prestanda eller datakvalitet listas i korta anteckningar. De representativa resultaten som presenteras här inkluderar differentiella HDX-data för blandningar av olika proteiner och naturliga varianter av nötkreatur β-laktoglobulin (β-lg), det viktigaste vassleproteinet som finns i mjölk9. Vi demonstrerar separationseffektivitet, reproducerbarhet och 2H-märkningsprestanda för de två rikliga varianterna av β-lg, dvs A och B10,11 under CE-baserad HDX och variantspecifik karakterisering av deras konformationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målen med att belägga CE-kapillärens innervägg innefattar minimering av det elektroosmotiska flödet och proteinabsorptionen under CE-processen13. Även om elektroosmotiskt flöde är fördelaktigt för konventionell CE-analys av små molekyler på grund av dess förmåga att driva neutrala eller motsatt laddade arter till detektorn, äventyrar det separationseffektiviteten hos proteinarter med liknande storlekar och nettoladdningar i lösning. Beläggning av kapillären med HPC minimerar det …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (NSFC 21974069). Författarna fick också stöd från Institute for Cell Analysis, Shenzhen Bay Laboratory, Kina; Jiangsu Collaborative Innovation Center för biomedicinska funktionella material; och Jiangsu Key Laboratory of Biomedical Materials vid Nanjing Normal University, Kina.
Materials
| ammonium acetate | Fisher Chemical | A/3446/50 | ≥99% |
| CESI 8000 plus capillary electrophoresis system | Sciex, USA | ||
| centrifuge | Eppendorf | 5406000097 | |
| centrifugal filter | Merck | UFC201024 | 10 kDa cutoff |
| deuterium oxide | Energy Chemical | E090001 | 99.9 % D |
| formic acid | Acros Organics | 270480250 | |
| fused silica glass capillary | Polymicro Technologies | 1068150017 | ID 50μm, OD 360μm |
| gas chromatography | Agilent | GC6890N | |
| hydrochloric acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| hydroxypropyl cellulose | Aladdin | H113415 | MW 100000 |
| magnetic stirrers | DLAB | 8030101212 | |
| methanol | Fisher Chemical | A456-4 | MS grade |
| microvolume UV-Vis spectrophotometer | DeNovix | 84677JK7731 | |
| myoglobin | Sigma Aldrich | M1882 | |
| Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific, USA | ||
| PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System | Beckman Coulter, USA | ||
| Q Exactive UHMR mass Spectrometer | Thermo Fisher Scientific, Germany | ||
| sodium hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | |
| ubiquitin | Sigma Aldrich | U6253 | |
| ultrasonicator | SCIENTZ | SB-5200 | |
| β-lactoglobulin | Sigma Aldrich | L0130 | |
References
- Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Pawlowski, J., Wang, G. Mass spectrometry-based methods in characterization of the higher order structure of protein therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 184, 113169 (2020).
- Engen, J. R., Botzanowski, T., Peterle, D., Georgescauld, F., Wales, T. E. Developments in hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Analytical Chemistry. 93 (1), 567-582 (2021).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Conformer-specific hydrogen exchange analysis of Abeta(1-42) oligomers by top-down electron capture dissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 83 (13), 5386-5393 (2011).
- Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. Structure and dynamics of small soluble Abeta(1-40) oligomers studied by top-down hydrogen exchange mass spectrometry. Biochimie. 51 (17), 3694-3703 (2012).
- Pan, J., Borchers, C. H. Top-down structural analysis of posttranslationally modified proteins by Fourier transform ion cyclotron resonance-MS with hydrogen/deuterium exchange and electron capture dissociation. Proteomics. 13 (6), 974-981 (2013).
- Wang, G., Abzalimov, R. R., Bobst, C. E., Kaltashov, I. A. Conformer-specific characterization of nonnative protein states using hydrogen exchange and top-down mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United. States of America. 110 (50), 20087-20092 (2013).
- Mironov, G. G., Clouthier, C. M., Akbar, A., Keillor, J. W., Berezovski, M. V. Simultaneous analysis of enzyme structure and activity by kinetic capillary electrophoresis-MS. Nature Chemical Biology. 12 (11), 918-922 (2016).
- Shen, Y., Zhao, X., Wang, G., Chen, D. D. Y. Differential hydrogen/deuterium exchange during proteoform separation enables characterization of conformational differences between coexisting protein states. Analytical Chemistry. 91 (6), 3805-3809 (2019).
- Kontopidis, G., Holt, C., Sawyer, L. Invited review: β-lactoglobulin: binding properties, structure, and function. Journal of Dairy Science. 87 (4), 785-796 (2004).
- Qin, B. Y., et al. Structural basis of the Tanford transition of bovine β-lactoglobulin. Biochimie. 37 (40), 14014-14023 (1998).
- Qin, B. Y., Bewley, M. C., Creamer, L. K., Baker, E. N., Jameson, G. B. Functional implications of structural differences between variants A and B of bovine beta-lactoglobulin. Protein Science. 8 (1), 75-83 (1999).
- Wang, L., et al. High resolution capillary isoelectric focusing mass spectrometry analysis of peptides, proteins, and monoclonal antibodies with a flow-through microvial interface. Analytical Chemistry. 90 (15), 9495-9503 (2018).
- Busch, M. H. A., Kraak, J. C., Poppe, H. Cellulose acetate-coated fused-silica capillaries for the separation of proteins by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 1695 (2), 287-296 (1995).
- Zhao, X., Shen, Y., Tong, W., Wang, G., Chen, D. D. Y. Deducing disulfide patterns of cysteine-rich proteins using signature fragments produced by top-down mass spectrometry. Analyst. 143 (4), 817-823 (2018).
- Sutera, S. P., Skalak, R. The history of Poiseuille’s law. Annual Review of Fluid Mechanics. 25 (1), 1-20 (1993).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Wang, G., Johnson, A. J., Kaltashov, I. A. Evaluation of electrospray ionization mass spectrometry as a tool for characterization of small soluble protein aggregates. Analytical Chemistry. 84 (3), 1718-1724 (2012).
- Fellers, R. T., et al. ProSight Lite: graphical software to analyze top-down mass spectrometry data. Proteomics. 15 (7), 1235-1238 (2015).
- Cai, W., et al. MASH Suite Pro: A comprehensive software tool for top-down proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (2), 703-714 (2016).
- Paterson, G. R., Hill, J. P., Otter, D. E. Separation of β-lactoglobulin A, B and C variants of bovine whey using capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography A. 700 (1), 105-110 (1995).
- Wang, G., Kaltashov, I. A. Approach to characterization of the higher order structure of disulfide-containing proteins using hydrogen/deuterium exchange and top-down mass spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (15), 7293-7298 (2014).
- Nicolardi, S., et al. On-line electrochemical reduction of disulfide bonds: improved FTICR-CID and -ETD coverage of oxytocin and hepcidin. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (12), 1980-1987 (2013).
- Adhikari, S., Xia, Y., McLuckey, S. A. Top-down analysis of disulfide-linked proteins using photoinduced radical reactions and ET-DDC. International Journal of Mass Spectrometry. 444, 116173 (2019).
- Rush, M. J. P., Riley, N. M., Westphall, M. S., Coon, J. J. Top-down characterization of proteins with intact disulfide bonds using activated-ion electron transfer dissociation. Analytical Chemistry. 90 (15), 8946-8953 (2018).
- Zhong, X., Maxwell, E. J., Chen, D. D. Y. Mass transport in a micro flow-through vial of a junction-at-the-tip capillary electrophoresis-mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 83 (12), 4916-4923 (2011).
