Kapillær elektroforesebasert hydrogen/deuteriumutveksling for konformasjonskarakterisering av proteiner med massespektrometri ovenfra og ned

Summary

Presentert her er en protokoll for en kapillær elektroforesebasert hydrogen / deuteriumutveksling (HDX) tilnærming kombinert med ovenfra og ned massespektrometri. Denne tilnærmingen karakteriserer forskjellen i høyere ordens strukturer mellom forskjellige proteinarter, inkludert proteiner i forskjellige tilstander og forskjellige proteoformer, ved å gjennomføre samtidig differensial HDX og elektroforetisk separasjon.

Abstract

Å løse konformasjonell heterogenitet av flere proteintilstander som sameksisterer i løsning, er fortsatt en av de viktigste hindringene i karakteriseringen av proteinterapeutikk og bestemmelse av konformasjonsovergangsveiene som er kritiske for biologiske funksjoner, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse. Hydrogen/deuterium utveksling (HDX) reaksjon kombinert med ovenfra og ned massespektrometrisk (MS) analyse gir et middel til å karakterisere protein høyere orden strukturer og dynamikk på en konform-spesifikk måte. Konformasjonsløsningskraften til denne teknikken er svært avhengig av effektiviteten ved å skille proteintilstander på intakt proteinnivå og minimere det gjenværende ikke-deutererte protiske innholdet under HDX-reaksjonene.

Her beskriver vi en kapillær elektroforese (CE)-basert variant av HDX MS-tilnærmingen som tar sikte på å forbedre konformasjonsoppløsningen. I denne tilnærmingen gjennomgår proteiner HDX-reaksjoner mens de migrerer gjennom en deutert bakgrunnselektrolyttløsning (BGE) under kapillær elektroforetisk separasjon. Ulike proteintilstander eller proteoformer som sameksisterer i oppløsning, kan effektivt separeres basert på deres forskjellige forhold mellom ladning og størrelse. Forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske løsningsmiddelmolekyler minimerer det gjenværende ikke-deutererte løsningsmidlet, noe som resulterer i et nesten komplett deuteringsmiljø under HDX-prosessen. Det gjennomstrømningsbaserte mikroviale CE-MS-grensesnittet muliggjør effektiv elektrosprayionisering av de eluterte proteinartene etter en rask blanding med slukke- og denatureringsmodifikatorløsningen ved utløpet av sprøyten. Den elektroniske ovenfra-og-ned MS-analysen måler det globale deuteringsnivået til de rømte intakte proteinartene, og deretter deutering av gassfasefragmentene. Dette dokumentet demonstrerer denne tilnærmingen i differensial HDX for systemer, inkludert de naturlige proteinvariantene som sameksisterer i melk.

Introduction

Å skille proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander og karakterisere deres strukturelle forskjeller er viktig for å overvåke overgangsveiene mellom disse artene som er involvert i biologiske hendelser, alt fra molekylær anerkjennelse til enzymatisk katalyse, og forstå mekanismene som ligger til grunn for disse hendelsene. Konvensjonelle biofysiske teknikker gir ikke en komplett løsning på grunn av begrensningene som utilstrekkelig oppløsning og tap av dynamisk informasjon i løsningen. Hydrogen/deuteriumutveksling kombinert med massespektrometri (HDX MS) er en teknikk som merker de strukturelle og konformasjonsmessige egenskapene til proteiner med deuterium (²H) via utvekslingen mellom labile hydrogenatomer av proteiner og ²H fra den bevisst introduserte ²H₂O-løsningen. Protoner involvert i hydrogenbinding eller som er beslaglagt fra løsningsmidlet i proteininteriøret, utveksles ikke lett¹. Dermed, ettersom valutakursen på et utvekslingssted er svært avhengig av sitt engasjement i høyere ordens strukturer, kan proteinstrukturene avsløres ved høy romlig oppløsning av MS som undersøker omfanget og hastigheten på ²H-opptak basert på de forskjellige atommassene mellom ¹H og ²H. I løpet av de siste tiårene har HDX MS blitt en fremragende vellykket teknikk for å studere proteinkonformasjoner og dynamikk².

I den klassiske nedenfra-og-opp-tilnærmingen til HDX MS er ensemblet av proteinarter i forskjellige konformasjons-, bindings- eller modifikasjonstilstander proteolysert uten separasjon på intakt proteinnivå, noe som gjør det umulig å karakterisere individuelle arter ved å analysere de resulterende proteolytiske fragmentene med innviklet deuteriuminnhold. I motsetning, i ovenfra og ned-tilnærmingen, gir forskjellige proteintilstander eller proteoformer som har innlemmet forskjellig deuteriuminnhold, opphav til flere distribusjoner av intakte proteinmasser i en MS-skanning. Dette gjør at individuelle arter kan skilles ved massevalg av ioner som tilsvarer hver massefordeling ved hjelp av et riktig massefilter (for eksempel en quadrupole) og karakteriseringen av deres konformasjonsforskjeller i den påfølgende tandem MS-analysen ^3,4,5,6. Effektiviteten av å skille proteintilstander eller proteoformer i denne strategien er imidlertid begrenset av omfanget av forskjell i deres tilsvarende massefordelinger.

Kapillær elektroforese (CE) gir et middel til å skille proteinarter basert på deres forskjellige ladninger og hydrodynamiske størrelser i løsningsfasen med høy effektivitet⁷. Kombinere CE med HDX tilbyr ytterligere separasjon av proteintilstander eller proteoformer i løsningsfasen. I tillegg tillater det lille volumet av CE-kapillæren utnyttelse av en fullt deutert løsning som bakgrunnselektrolyttløsning (BGE), det vil si løpebufferen, som gjengir kapillæren som en HDX-reaktor for proteinprøver. På grunn av forskjellen i elektroforetisk mobilitet mellom proteiner og protiske reagenser i elektroforeseprosessen, resulterer det i et nesten komplett deuteringsmiljø for proteinanalyttene med minimalt gjenværende ikke-deutert innhold, og dermed forbedrer følsomheten til strukturanalysen ved hjelp av HDX-data. Som sådan utviklet vi en CE-basert differensial HDX-tilnærming kombinert med ovenfra og ned MS for å karakterisere protein høyere orden strukturer på en tilstands- eller proteoform-spesifikk måte⁸.

Dette dokumentet beskriver protokoller for denne tilnærmingen ved å detaljere trinnene for materialforberedelse, eksperimentell prosedyre og dataanalyse. Faktorer som kan påvirke metodeytelsen eller datakvaliteten, vises i korte merknader. De representative resultatene som presenteres her inkluderer differensial HDX-data av blandinger av forskjellige proteiner og naturlige varianter av storfe β-lactoglobulin (β-lg), det store myseproteinet som finnes i melk⁹. Vi demonstrerer separasjonseffektivitet, reproduserbarhet og ²H-merkingsytelse av de to rikelige variantene av β-lg, det vil si A og B^10,11 under CE-basert HDX og variantspesifikk karakterisering av deres konformasjoner.

Protocol

MERK: Bruk hplc-grade (high-performance liquid chromatography) eller MS-reagenser når det er mulig for å minimere forurensningene som kan forstyrre MS-analysen. Ikke berør CE-MS-grensesnittet med bare hender under målingen for å unngå muligheten for elektrisk støt forårsaket av enten elektroforetisk spenning eller elektrosprayspenning. 1. Materialforberedelse Modifikasjon av smeltet silika kapillær for CE Forbered en 5% (w / w) hydroksypropylcellulose (HPC) løsning …

Representative Results

Endring av infusjonstrykket til BGE gjør det mulig å justere både separasjonseffektivitet og migrasjonstid, noe som tilsvarer HDX-reaksjonstiden til proteinene som skal separeres (figur 3). Et lavere infusjonstrykk resulterer i bedre separasjon av CE-topper på bekostning av eksperimentets varighet (figur 3A). En lengre migrerings-/HDX-reaksjonstid resulterer i et høyere nivå av deutering av proteinanalyttene (figur 3B-D<strong…

Discussion

Målene med å belegge den indre veggen til CE-kapillæren inkluderer minimering av elektroosmotisk strømning og proteinabsorpsjon under CE-prosessen¹³. Selv om elektroosmotisk strømning er gunstig for konvensjonell CE-analyse av små molekyler på grunn av dens evne til å drive nøytrale eller motsatt ladede arter til detektoren, kompromitterer den separasjonseffektiviteten til proteinarter med lignende størrelser og netto kostnader i løsningen. Belegg kapillæren med HPC minimerer den elekt…

Materials

ammonium acetate	Fisher Chemical	A/3446/50	≥99%
CESI 8000 plus capillary electrophoresis system	Sciex, USA
centrifuge	Eppendorf	5406000097
centrifugal filter	Merck	UFC201024	10 kDa cutoff
deuterium oxide	Energy Chemical	E090001	99.9 % D
formic acid	Acros Organics	270480250
fused silica glass capillary	Polymicro Technologies	1068150017	ID 50μm, OD 360μm
gas chromatography	Agilent	GC6890N
hydrochloric acid	Sigma Aldrich	258148
hydroxypropyl cellulose	Aladdin	H113415	MW 100000
magnetic stirrers	DLAB	8030101212
methanol	Fisher Chemical	A456-4	MS grade
microvolume UV-Vis spectrophotometer	DeNovix	84677JK7731
myoglobin	Sigma Aldrich	M1882
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific, USA
PA 800 Plus Pharmaceutical Analysis CE System	Beckman Coulter, USA
Q Exactive UHMR mass Spectrometer	Thermo Fisher Scientific, Germany
sodium hydroxide	Sigma Aldrich	S5881
ubiquitin	Sigma Aldrich	U6253
ultrasonicator	SCIENTZ	SB-5200
β-lactoglobulin	Sigma Aldrich	L0130