Пространственно-временная визуализация in vivo систем доставки глазных лекарств с использованием волоконно-оптической конфокальной лазерной микроскопии
Summary
Представлен протокол применения фиброоптической конфокальной лазерной микроскопии (КМЛМ) для неинвазивного изучения пространственно-временного распределения липосом в глазу после субконъюнктивальной инъекции.
Abstract
Субконъюнктивальная инъекция является привлекательным способом введения глазных препаратов из-за легкого транссклерального доступа, который обходит передние глазные барьеры, такие как роговица и конъюнктива. В то время как терапевтические эффекты и фармакокинетика лекарств при субконъюнктивальной инъекции были описаны в некоторых исследованиях, очень немногие оценивают глазное распределение лекарств или системы доставки лекарств (DDS). Последнее имеет решающее значение для оптимизации внутриглазной конструкции DDS и биодоступности препарата для достижения желаемой глазной локализации и продолжительности действия (например, острого и пролонгированного). Данное исследование устанавливает использование волоконно-оптической конфокальной лазерной микроэндоскопии (CLM) для качественного изучения глазного распределения флуоресцентных липосом в режиме реального времени у живых мышей после субконъюнктивальной инъекции. Будучи разработанным для визуального осмотра тканей in vivo на микроскопическом уровне, это также первое полное описание метода визуализации CLM для изучения пространственно-временного распределения инъекционных препаратов в глазу после субконъюнктивальной инъекции.
Introduction
Очищение крови, распределение тканей и целевое заполнение лекарств в живых системах являются столпами для понимания диспозиции лекарств in vivo. В доклинических моделях на животных эти параметры обычно оцениваются путем частого забора крови и тканей в определенные моменты времени после введения препарата. Тем не менее, эти процедуры, как правило, являются инвазивными, часто включают измерения невыявляемости и требуют больших когорт животных для статистического питания. Могут возникнуть дополнительные расходы и время, а также этические проблемы чрезмерного использования животных. В результате неинвазивная визуализация быстро становится неотъемлемым шагом в исследованиях биораспределения. Конфокальная лазерная микроэндоскопия (CLM1,2) хорошо подходит для глазных применений для неинвазивного изображения пространственно-временного распределения терапевтических средств в глазах живых животных с высокой чувствительностью и высоким разрешением1,3,4.
CLM обладает потенциалом для облегчения надежного скрининга систем доставки глазных лекарств (DDS), таких как липосомы, до всесторонней количественной оценки DDS и биодоступности лекарств. Липосомы привлекательны своей гибкостью в настройке своих физико-химических и биофизических свойств5,6,7,8,9,10,11 для инкапсуляции большого разнообразия терапевтического груза и контроля тканевого места высвобождения лекарственного средства и продолжительности действия. Липосомы использовались в глазных приложениях для доставки больших молекул, таких как моноклональное антитело бевацизумаб12, и малых молекул, таких как циклоспорин13 и ганцикловир14. Липосомы, нагруженные лекарственными средствами, имеют более длительные биологические периоды полураспада и длительные терапевтические эффекты по сравнению с нелипосомными составами «свободных лекарств». Однако распределение лекарственного средства в глазной ткани обычно экстраполируется из концентраций лекарственного средства в жидких компонентах глаза (т.е. крови, водной влаге и стекловидном теле15,16,17). Поскольку первоначальная судьба in vivo загруженного лекарственного груза определяется свойствами самого нанонесущего, CLM-визуализация флуоресцентных липосом может служить суррогатом для лекарственного средства, чтобы выявить нацеливание на ткань и время пребывания ткани in situ. Кроме того, визуальные доказательства доставки с CLM могут направлять редизайн DDS, оценивать терапевтические преимущества препарата и, возможно, даже прогнозировать неблагоприятные биологические события (например, токсичность тканей из-за нежелательной локализации DDS в течение длительных периодов времени).
Здесь подробно описана пошаговая процедура изучения глазного биораспределения липосом у живых мышей с двухдиапазонной системой CLM. Эта специальная система CLM может обнаруживать двухцветную флуоресценцию (с зелеными и красными лазерами возбуждения при 488 нм и 660 нм) в режиме реального времени с частотой 8 кадров / с. Физически помещая зонд обнаружения на глаз, протокол демонстрирует получение и анализ изображений зелено-флуоресцентных липосом при субконъюнктивальном введении у мышей, предварительно введенных внутривенно (IV) с 2% красителем Evans Blue (EB). Краситель EB помогает визуализировать васкуляризованные структуры в красном флуоресцентном канале. Мы показываем репрезентативные результаты исследования, оценивающего 100 нм нейтральных липосом, состоящих из фосфолипида POPC (т.е. 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолина) и легированных флуоресцеин-меченым фосфолипидом Fl-DHPE (т.е. N-(флуоресцеин-5-тиокарбамоил)-1,2-дигекса-деканоилсн-глицеро-3-фосфоэтаноламин) в соотношении 95% POPC: 5% Fl-DHPE (Рисунок 1B ). CLM способен захватывать зеленые флуоресцеин-меченые липосомы с осевым разрешением 15 мкм и боковым разрешением 3,30 мкм путем очерчивания границ глазной ткани, окрашенной EB.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как показано из результатов, CLM предоставляет простой и осуществимый метод для изображения глазного распределения липосом в глазу. Ранее мы продемонстрировали использование CLM для характеристики локализации различных липосомальных составов в глазу мыши с течением времени1</…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование финансировалось грантом NTU-Северо-Западного института наномедицины (NNIN), присужденным (SV), и частично грантом Сингапурского национального исследовательского фонда AG / CIV / GC70-C / NRF / 2013/2 и грантом Сингапура по здравоохранению и биомедицинским наукам (HBMS) Industry Alignment Fund Pre-Positioning (IAF-PP) H18/01/a0/018, администрируемым Агентством по науке, технологиям и исследованиям (A*STAR) (для AMC). Спасибо членам Лаборатории трансляционной и молекулярной визуализации Duke-NUS (LTMI) за содействие логистике и проведению исследований и обучению на оборудовании. Особая благодарность г-же Висне Новере за ее редакционную помощь.
Materials
| 0.08 µm polycarbonate filter | Whatman, USA | 110604 | |
| 0.22 µm syringe filter | Fisherbrand, Ireland | 09-720-3 | |
| 0.5% Proxymetacaine hydrochloride sterile opthalmic solution | Alcon, Singapore | ||
| 10 µL Glass Syringe | Hamilton, USA | 65460-06 | |
| 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) | Avanti, USA | 850457 | |
| 32 G needle (Hamilton, 0.5” PT4) | Hamilton, USA | 7803-04 | |
| Animal Temperature Controller with heating plate (15 cm x 20 cm) | WPI, USA | ATC 2000 & 61800 | |
| Cellvizio Dual Band, S1500 Probe and Quantikit (Calibration kit in step 3.5) | Mauna Kea Technologies, France | Tip diameter: 1.5 mm, field of view: 600 µm x 500 µm, axial resolution: 15 µm, lateral resolution: 3.3 µm | |
| Chloroform | Sigma Aldrich, USA | 472476 | |
| Dumont Tweezers #5, Dumostar | WPI, USA | 500233 | 11 cm, Straight, 0.1 mm x 0.06 mm Tips |
| Evans Blue | Sigma Aldrich, USA | E2129 | |
| Fusidic acid eye drop | LEO Pharma, Denmark | ||
| ImageJ | National Institutes of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Isoflurane | Piramal, USA | ||
| Malvern Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical, UK | ||
| Methanol | Sigma Aldrich, USA | 179337 | |
| Mini Extruder | Avanti, USA | 610020 | |
| N-(fluorescein-5-thiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoylsn-glycero-3-phosphoethanolamine (triethylammonium salt) (FL-DHPE) | Invitrogen, USA | F362 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco, USA | 10010023 | |
| Stereomicroscope System with table clamp stand | Olympus, Tokyo, Japan | SZ51 & SZ2-STU3 |
References
- Chaw, S. Y., Novera, W., Chacko, A. -. M., Wong, T. T. L., Venkatraman, S. In vivo fate of liposomes after subconjunctival ocular delivery. Journal of Controlled Release. 329, 162-174 (2021).
- Kuo, J. C. -. H., et al. Detection of colorectal dysplasia using fluorescently labelled lectins. Scientific Reports. 6 (1), 24231 (2016).
- Wu, Y. -. F., et al. A custom multiphoton microscopy platform for live imaging of mouse cornea and conjunctiva. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60944 (2020).
- Zhivov, A., Stachs, O., Kraak, R., Stave, J., Guthoff, R. F. In vivo confocal microscopy of the ocular surface. The Ocular Surface. 4 (2), 81-93 (2006).
- Bassyouni, F., ElHalwany, N., Ab del Rehim, M., Neyfeh, M. Advances and new technologies applied in controlled drug delivery system. Research on Chemical Intermediates. 41 (4), 2165-2200 (2015).
- Sercombe, L., et al. Advances and challenges of liposome assisted drug delivery. Frontiers in Pharmacology. 6, (2015).
- Koning, G. A., Storm, G. Targeted drug delivery systems for the intracellular delivery of macromolecular drugs. Drug Discovery Today. 8 (11), 482-483 (2003).
- Metselaar, J. M., Storm, G. Liposomes in the treatment of inflammatory disorders. Expert Opinion on Drug Delivery. 2 (3), 465-476 (2005).
- Ding, B. S., Dziubla, T., Shuvaev, V. V., Muro, S., Muzykantov, V. R. Advanced drug delivery systems that target the vascular endothelium. Molecular Interventions. 6 (2), 98-112 (2006).
- Hua, S., Wu, S. Y. The use of lipid-based nanocarriers for targeted pain therapies. Frontiers in Pharmacology. 4, 143 (2013).
- Sharma, A., Sharma, U. S. Liposomes in drug delivery: Progress and limitations. International Journal of Pharmaceutics. 154 (2), 123-140 (1997).
- Abrishami, M. M., et al. Preparation, characterization, and in vivo evaluation of nanoliposomes-encapsulated Bevacizumab (Avastin) for intravitreal administration. Retina. 29 (5), 699-703 (2009).
- Pleyer, U., et al. Ocular absorption of cyclosporine A from liposomes incorporated into collagen shields. Current Eye Research. 13 (3), 177-181 (1994).
- Shen, Y., Tu, J. Preparation and ocular pharmacokinetics of ganciclovir liposomes. The AAPS Journal. 9 (3), 371-377 (2007).
- Weijtens, O., et al. High concentration of dexamethasone in aqueous and vitreous after subconjunctival injection. American Journal of Ophthalmology. 128 (2), 192-197 (1999).
- Voss, K., et al. Development of a novel injectable drug delivery system for subconjunctival glaucoma treatment. Journal of Controlled Release. 214, 1-11 (2015).
- Giarmoukakis, A., et al. Biodegradable nanoparticles for controlled subconjunctival delivery of latanoprost acid: In vitro and in vivo evaluation. Preliminary results. Experimental Eye Research. 112, 29-36 (2013).
- Shah, N. V., et al. Intravitreal and subconjunctival melphalan for retinoblastoma in transgenic mice. Journal of Ophthalmology. 2014, 829879 (2014).
- Dastjerdi, M. H., Sadrai, Z., Saban, D. R., Zhang, Q., Dana, R. Corneal Penetration of Topical and Subconjunctival Bevacizumab. Investigative ophthalmology & visual science. 52 (12), 8718-8723 (2011).
- Ezra-Elia, R., et al. Can an in vivo imaging system be used to determine localization and biodistribution of AAV5-mediated gene expression following subretinal and intravitreal delivery in mice. Experimental Eye Research. 176, 227-234 (2018).
- Movila, A., et al. Intravital endoscopic technology for real-time monitoring of inflammation caused in experimental periodontitis. Journal of Immunological Methods. 457, 26-29 (2018).
- Vanherp, L., et al. Bronchoscopic fibered confocal fluorescence microscopy for longitudinal in vivo assessment of pulmonary fungal infections in free-breathing mice. Scientific Reports. 8 (1), 3009 (2018).
- Chagnon, F., et al. In vivo intravital endoscopic confocal fluorescence microscopy of normal and acutely injured rat lungs. Laboratory Investigation. 90 (6), 824-834 (2010).
- Yun, J. Y., et al. The effect of near-infrared fluorescence conjugation on the anti-cancer potential of cetuximab. Laboratory Animal Research. 34 (1), 30-36 (2018).
