Formering af tand- og åndedrætsceller og organer i mikrogravity
Summary
Denne protokol præsenterer en metode til dyrkning og 3D-vækst af ameloblast-lignende celler i mikrogravity for at opretholde deres aflange og polariserede form samt emaljespecifikke proteinekspression. Kulturbetingelser for kulturen af periodontale ingeniørkonstruktioner og lungeorganer i mikrogravitet er også beskrevet.
Abstract
Tyngdekraften er en af de vigtigste determinanter for menneskelig cellefunktion, proliferation, cytoskeletal arkitektur og orientering. Roterende bioreaktorsystemer (RCCS’er) efterligner tabet af tyngdekraften, når det forekommer i rummet, og giver i stedet et mikrogravitetsmiljø gennem kontinuerlig rotation af dyrkede celler eller væv. Disse RCCS’er sikrer en uafbrudt forsyning af næringsstoffer, vækst- og transkriptionsfaktorer og ilt og adresserer nogle af manglerne ved tyngdekraften i ubevægelige 2D (todimensionelle) celle- eller organkulturretter. I denne undersøgelse har vi brugt RCCS’er til at samdyrke cervikale loopceller og tandmasseceller til at blive ameloblaster, til at karakterisere periodontale stamfader / stilladsinteraktioner og til at bestemme effekten af betændelse på lungealveoler. RCCS-miljøerne lettede væksten af ameloblast-lignende celler, fremmede periodontal progenitorproliferation som reaktion på stilladsbelægninger og tillod en vurdering af virkningerne af inflammatoriske ændringer på dyrkede lungealveoler. Dette manuskript opsummerer miljøforholdene, materialerne og trinene undervejs og fremhæver kritiske aspekter og eksperimentelle detaljer. Afslutningsvis er RCCS’er innovative værktøjer til at mestre kulturen og 3D (tredimensionel) vækst af celler in vitro og give mulighed for undersøgelse af cellulære systemer eller interaktioner, der ikke er modtagelige for klassiske 2D-kulturmiljøer.
Introduction
Tyngdekraften påvirker alle aspekter af livet på Jorden, herunder biologien af individuelle celler og deres funktion i organismer. Celler registrerer tyngdekraften gennem mekanoreceptorer og reagerer på ændringer i tyngdekraften ved at omkonfigurere cytoskeletale arkitekturer og ved at ændre celledeling 1,2,3. Andre virkninger af mikrogravitet inkluderer det hydrostatiske tryk i væskefyldte vesikler, sedimentering af organeller og opdriftsdrevet konvektion af flow og varme4. Undersøgelser af effekten af tab af tyngdekraft på humane celler og organer blev oprindeligt udført for at simulere det vægtløse miljø i rummet på astronauter under rumflyvningsmissioner5. I de senere år er disse 3D-bioreaktorteknologier, der oprindeligt blev udviklet af NASA til at simulere mikrogravitet, imidlertid blevet mere og mere relevante som nye tilgange til kulturen af cellepopulationer, der ellers ikke er modtagelige for 2D-kultursystemer.
3D-bioreaktorer simulerer mikrogravitet ved at dyrke celler i suspension og dermed skabe en konstant “frit fald” -effekt. Andre fordele ved de roterende bioreaktorer omfatter manglen på lufteksponering i organkultursystemer, en reduktion i forskydningsspænding og turbulens og en kontinuerlig eksponering for en skiftende forsyning af næringsstoffer. Disse dynamiske betingelser leveret af en Rotary Cell Culture System (RCCS) bioreaktor favoriserer rumlig co-lokalisering og tredimensionel samling af enkeltceller i aggregater 6,7.
Tidligere undersøgelser har vist fordelene ved en roterende bioreaktor til knogleregenerering8, tandkimkultur9 og til dyrkning af humane tandfollikelceller10. Der har også været en rapport, der tyder på, at RCCS forbedrer EOE-celleproliferation og differentiering i ameloblaster11. Imidlertid blev differentierede celler betragtet som ameloblaster baseret på ameloblastinimmunfluorescens og / eller amelogeninekspression alene11 uden at overveje deres aflange morfologi eller polariserede celleform.
Ud over den NASA-udviklede roterende vægbeholder (RWV) bioreaktor omfatter andre teknologier til generering af 3D-aggregater fra celler magnetisk levitation, den tilfældige positioneringsmaskine (RPM) og clinostat12. For at opnå magnetisk levitation leviteres celler mærket med magnetiske nanopartikler ved hjælp af en ekstern magnetisk kraft, hvilket resulterer i dannelsen af stilladsfrie 3D-strukturer, der er blevet brugt til biofabrikation af adipocytstrukturer13,14,15. En anden tilgang til simulering af mikrogravitet er dannelsen af multidirektionelle G-kræfter ved at kontrollere samtidig rotation omkring to akser, hvilket resulterer i en annullering af den kumulative tyngdekraftsvektor i midten af en enhed kaldet clinostat16. Når knoglemarvsstamceller blev dyrket i en clinostat, blev ny knogledannelse hæmmet gennem undertrykkelse af osteoblastdifferentiering, hvilket illustrerer en af de dedifferentierende virkninger af mikrogravitet16.
In vitro-systemer til at lette den trofaste ameloblastkultur ville være et stort skridt fremad mod tandemaljevævsteknik17. Desværre har ameloblastskulturen indtil nu været en udfordrende opgave18,19. Indtil videre er fem forskellige ameloblast-lignende cellelinjer blevet rapporteret, herunder musens ameloblast-afstamningscellelinje (ALC), rottetandepitelcellelinjen (HAT-7), musens LS8-cellelinje20, den svine PABSo-E-cellelinje 21 og rotten SF2-24 cellelinje22. Imidlertid har størstedelen af disse celler mistet deres karakteristiske polariserede celleform i 2D-kultur.
I denne undersøgelse har vi henvendt os til et Rotary Cell Culture Bioreactor System (RCCS) for at lette væksten af ameloblastlignende celler fra cervikal loop-epitelia, der er samdyrket med mesenkymale forfædre og for at overvinde udfordringerne ved 2D-kultursystemer, herunder reduceret strøm af næringsstoffer og cytoskeletale ændringer på grund af tyngdekraften. Derudover har RCCS givet nye muligheder for undersøgelse af celle / stilladsinteraktioner relateret til periodontal vævsteknik og til at undersøge virkningerne af inflammatoriske mediatorer på lungealveolært væv in vitro. Tilsammen fremhæver resultaterne fra disse undersøgelser fordelene ved mikrogravity-baserede rotatoriske kultursystemer til udbredelse af differentieret epitel og til vurdering af miljøvirkninger på celler dyrket in vitro, herunder celle/stilladsinteraktioner og vævets respons på inflammatoriske tilstande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i protokollen for vækst af celler i mikrogravitet inkluderer bioreaktoren, stilladset, cellerne, der anvendes til 3D-kultur, og stilladsbelægningen som et middel til at inducere celledifferentiering. Den type bioreaktor, der anvendes i vores undersøgelser, omfatter RCCS-4 bioreaktoren, en nylig ændring af det originale Rotary Cell Culture System (RCCS) roterende cylindrisk vævskulturenhed udviklet af NASA til at dyrke celler i simuleret mikrogravitet. Dette RCCS-4-miljø giver ekstremt lave forskydning…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Undersøgelser blev generøst støttet af tilskud fra National Institute of Dental and Craniofacial Research (UG3-DE028869 og R01-DE027930).
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au – Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
