미세중력에서 치과 및 호흡기 세포와 장기의 전파
Summary
이 프로토콜은 미세중력에서 아멜로모세포 유사 세포의 배양 및 3D 성장을 통해 길쭉하고 분극된 형태와 에나멜 특이적 단백질 발현을 유지하는 방법을 제시합니다. 미세 중력에서 치주 공학 구조물 및 폐 기관의 배양을위한 배양 조건도 설명됩니다.
Abstract
중력은 인간 세포 기능, 증식, 세포골격 구조 및 방향의 핵심 결정 요인 중 하나입니다. 회전식 생물 반응기 시스템 (RCCS)은 우주에서 발생하는 중력 손실을 모방하고 대신 배양 된 세포 또는 조직의 연속 회전을 통해 미세 중력 환경을 제공합니다. 이러한 RCCS는 영양소, 성장 및 전사 인자, 산소의 중단 없는 공급을 보장하고 움직이지 않는 2D(2차원) 세포 또는 장기 배양 접시에서 중력의 일부 단점을 해결합니다. 본 연구에서 우리는 RCCS를 사용하여 자궁 경부 루프 세포와 치수 세포를 공동 배양하여 ameloblasts가되고, 치주 전구 세포 / 스캐 폴드 상호 작용을 특성화하고, 폐 폐포에 대한 염증의 영향을 결정했습니다. RCCS 환경은 아멜로모세포 유사 세포의 성장을 촉진하고, 스캐폴드 코팅에 반응하여 치주 전구체 증식을 촉진했으며, 배양된 폐포에 대한 염증 변화의 영향을 평가할 수 있었습니다. 이 원고는 환경 조건, 재료 및 단계를 요약하고 중요한 측면과 실험 세부 사항을 강조합니다. 결론적으로, RCCS는 시험관 내 세포의 배양 및 3D(3차원) 성장을 마스터하고 기존의 2D 배양 환경에 적합하지 않은 세포 시스템 또는 상호 작용을 연구할 수 있는 혁신적인 도구입니다.
Introduction
중력은 개별 세포의 생물학과 유기체 내에서의 기능을 포함하여 지구상의 생명체의 모든 측면에 영향을 미칩니다. 세포는 기계 수용체를 통해 중력을 감지하고 세포 골격 구조를 재구성하고 세포 분열 1,2,3을 변경하여 중력 변화에 반응합니다. 미세 중력의 다른 영향으로는 유체로 채워진 소포의 정수압, 세포 기관의 침강, 흐름과 열의 부력 구동 대류4가 있습니다. 인간 세포와 기관에 대한 중력 손실의 영향에 대한 연구는 원래 우주 비행 임무 중 우주 비행사에 대한 우주의 무중력 환경을 시뮬레이션하기 위해 수행되었습니다5. 그러나 최근 몇 년 동안 NASA가 원래 미세 중력을 시뮬레이션하기 위해 개발 한 이러한 3D 생물 반응기 기술은 2D 배양 시스템에 적용 할 수없는 세포 집단의 배양을위한 새로운 접근 방식으로 점점 더 관련성이 높아지고 있습니다.
3D 바이오리액터는 현탁액에서 세포를 성장시켜 일정한 “자유 낙하” 효과를 생성하여 미세 중력을 시뮬레이션합니다. 회전식 바이오리액터의 다른 장점으로는 장기 배양 시스템에서 발생하는 공기 노출 부족, 전단 응력 및 난류 감소, 변화하는 영양소 공급에 대한 지속적인 노출 등이 있습니다. 회전식 세포 배양 시스템(RCCS) 생물반응기가 제공하는 이러한 동적 조건은 공간 공동 국소화 및 단일 세포를 응집체로 3차원 조립하는 데유리합니다6,7.
이전 연구에서는 뼈 재생8, 치아 배아 배양9 및 인간 치용 여포 세포배양10을 위한 회전식 바이오리액터의 이점을 입증했습니다. RCCS가 EOE 세포 증식 및 ameloblasts11로의 분화를 향상시킨다는 보고도 있었다. 그러나, 분화된 세포는 그들의 길쭉한 형태 또는 편광된 세포 형태를 고려하지 않고 아멜로블라스틴 면역형광 및/또는 아멜로게닌 발현 단독11 에 기초한 아멜로모세포로 간주되었다.
NASA가 개발한 회전 벽 용기(RWV) 바이오리액터 외에도 세포에서 3D 응집체를 생성하는 다른 기술로는 자기 부상, 랜덤 포지셔닝 머신(RPM) 및 clinostat12가 있습니다. 자기 부상 달성을 달성하기 위해, 자성 나노 입자로 표지 된 세포는 외부 자기력을 사용하여 부상되고, 지방 세포 구조13,14,15의 생체 가공에 사용 된 스캐 폴드가없는 3D 구조의 형성을 초래한다. 미세중력을 시뮬레이션하기 위한 또 다른 접근법은 clinostat16이라는 장치의 중심에서 누적 중력 벡터의 상쇄를 초래하는 2개의 축에 대한 동시 회전을 제어함으로써 다방향 G 힘의 생성이다. 골수 줄기세포를 클리노스탯에서 배양하였을 때, 조골세포 분화의 억제를 통해 새로운 골형성이 억제되었으며, 이는 미세중력의 역분화 효과 중 하나를 예시한다16.
ameloblasts의 충실한 배양을 촉진하기위한 시험관 내 시스템은 치아 법랑질 조직 공학17을 향한 중요한 진전을 제공 할 것이다. 불행히도, 현재까지 ameloblasts의 문화는 도전적인 사업이었습니다18,19. 지금까지 마우스 아멜로모세포 계통 세포주(ALC), 래트 치과 상피 세포주(HAT-7), 마우스 LS8 세포주20, 돼지 PABSo-E 세포주 21 및 래트 SF2-24 세포주22를 포함하여 5개의 서로 다른 아멜로모세포 유사 세포주가 보고되었습니다. 그러나 이러한 세포의 대부분은 2D 배양에서 독특한 편광 세포 모양을 잃었습니다.
본 연구에서 우리는 중간엽 전구세포와 공동 배양된 자궁경부 루프 상피에서 아멜로모세포 유사 세포의 성장을 촉진하고 영양분의 흐름 감소 및 중력으로 인한 세포골격 변화를 포함한 2D 배양 시스템의 문제를 극복하기 위해 회전식 세포 배양 생물반응기 시스템(RCCS)으로 전환했습니다. 또한 RCCS는 치주 조직 공학과 관련된 세포/스캐폴드 상호작용을 연구하고 시험관 내에서 폐포 조직에 대한 염증 매개체의 효과를 조사하기 위한 새로운 방법을 제공했습니다. 함께, 이러한 연구의 결과는 분화된 상피의 전파 및 세포/스캐폴드 상호 작용 및 염증 상태에 대한 조직 반응을 포함하여 시험관 내에서 성장한 세포에 대한 환경 영향 평가를 위한 미세 중력 기반 회전 배양 시스템의 이점을 강조합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미세중력에서 세포의 성장을 위한 프로토콜의 중요한 단계는 세포 분화를 유도하는 수단으로서 생물반응기, 스캐폴드, 3D 배양에 사용되는 세포, 및 스캐폴드 코팅을 포함한다. 우리 연구에 사용 된 생물 반응기의 유형은 시뮬레이션 된 미세 중력에서 세포를 성장시키기 위해 NASA가 개발 한 원래의 회전 세포 배양 시스템 (RCCS) 회전 원통형 조직 배양 장치의 최근 수정 인 RCCS-4 생물 반응기로 구성?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
연구는 국립 치과 및 두개 안면 연구소 (UG3-DE028869 및 R01-DE027930)의 보조금으로 아낌없이 지원되었습니다.
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
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