Propagación de células y órganos dentales y respiratorios en microgravedad
Summary
Este protocolo presenta un método para el cultivo y crecimiento 3D de células similares a ameloblastos en microgravedad para mantener su forma alargada y polarizada, así como la expresión de proteínas específicas del esmalte. También se describen las condiciones de cultivo para el cultivo de construcciones de ingeniería periodontal y órganos pulmonares en microgravedad.
Abstract
La gravedad es uno de los determinantes clave de la función celular humana, la proliferación, la arquitectura citoesquelética y la orientación. Los sistemas de biorreactores rotativos (RCCS) imitan la pérdida de gravedad a medida que ocurre en el espacio y, en cambio, proporcionan un entorno de microgravedad a través de la rotación continua de células o tejidos cultivados. Estos RCCS aseguran un suministro ininterrumpido de nutrientes, factores de crecimiento y transcripción, y oxígeno, y abordan algunas de las deficiencias de las fuerzas gravitacionales en placas de cultivo de células u órganos 2D (bidimensionales) inmóviles. En el presente estudio hemos utilizado CCR para cocultivar células del asa cervical y células de la pulpa dental para que se conviertan en ameloblastos, para caracterizar las interacciones progenitor/andamio periodontal y para determinar el efecto de la inflamación sobre los alvéolos pulmonares. Los entornos de RCCS facilitaron el crecimiento de células similares a los ameloblastos, promovieron la proliferación de progenitores periodontales en respuesta a los recubrimientos de andamios y permitieron una evaluación de los efectos de los cambios inflamatorios en los alvéolos pulmonares cultivados. Este manuscrito resume las condiciones ambientales, los materiales y los pasos a lo largo del camino y destaca los aspectos críticos y los detalles experimentales. En conclusión, los RCCS son herramientas innovadoras para dominar el cultivo y el crecimiento 3D (tridimensional) de células in vitro y para permitir el estudio de sistemas celulares o interacciones no susceptibles a entornos de cultivo 2D clásicos.
Introduction
La gravedad afecta todos los aspectos de la vida en la Tierra, incluida la biología de las células individuales y su función dentro de los organismos. Las células detectan la gravedad a través de mecanorreceptores y responden a los cambios en la gravedad reconfigurando las arquitecturas citoesqueléticas y alterando la división celular 1,2,3. Otros efectos de la microgravedad incluyen la presión hidrostática en vesículas llenas de fluido, la sedimentación de orgánulos y la convección impulsada por flotabilidad del flujo y el calor4. Los estudios sobre el efecto de la pérdida de gravedad en las células y órganos humanos se realizaron originalmente para simular el entorno ingrávido del espacio en astronautas durante misiones de vuelo espacial5. Sin embargo, en los últimos años, estas tecnologías de biorreactores 3D desarrolladas originalmente por la NASA para simular la microgravedad se están volviendo cada vez más relevantes como enfoques novedosos para el cultivo de poblaciones celulares que de otro modo no serían susceptibles a los sistemas de cultivo 2D.
Los biorreactores 3D simulan la microgravedad haciendo crecer células en suspensión y creando así un efecto constante de “caída libre”. Otras ventajas de los biorreactores rotativos incluyen la falta de exposición al aire que se encuentra en los sistemas de cultivo de órganos, una reducción en el esfuerzo cortante y la turbulencia, y una exposición continua a un suministro cambiante de nutrientes. Estas condiciones dinámicas proporcionadas por un biorreactor del Sistema de Cultivo Celular Rotatorio (RCCS) favorecen la colocalización espacial y el ensamblaje tridimensional de células individuales en agregados 6,7.
Estudios previos han demostrado las ventajas de un biorreactor rotatorio para la regeneración ósea8, el cultivo de gérmenes dentales9 y para el cultivo de células del folículo dental humano10. También ha habido un informe que sugiere que el CCR mejora la proliferación y diferenciación de células EOE en ameloblastos11. Sin embargo, las células diferenciadas fueron consideradas ameloblastos basadas en la inmunofluorescencia de ameloblastina y/o expresión de amelogenina sola11 sin considerar su morfología alargada o forma celular polarizada.
Además del biorreactor de vasos de pared giratoria (RWV) desarrollado por la NASA, otras tecnologías para generar agregados 3D a partir de células incluyen la levitación magnética, la máquina de posicionamiento aleatorio (RPM) y el clinostat12. Para lograr la levitación magnética, las células marcadas con nanopartículas magnéticas son levitadas utilizando una fuerza magnética externa, lo que resulta en la formación de estructuras 3D sin andamios que se han utilizado para la biofabricación de estructuras de adipocitos13,14,15. Otro enfoque para simular la microgravedad es la generación de fuerzas G multidireccionales mediante el control de la rotación simultánea alrededor de dos ejes, lo que resulta en una cancelación del vector de gravedad acumulativo en el centro de un dispositivo llamado clinostat16. Cuando las células madre de la médula ósea se cultivaron en un clinostato, se inhibió la formación de hueso nuevo a través de la supresión de la diferenciación de osteoblastos, ilustrando uno de los efectos desdiferenciadores de la microgravedad16.
Los sistemas in vitro para facilitar el cultivo fiel de ameloblastos proporcionarían un gran paso adelante hacia la ingeniería del tejido del esmalte dental17. Desafortunadamente, hasta la fecha, el cultivo de los ameloblastos ha sido una tarea desafiante18,19. Hasta ahora, se han reportado cinco líneas celulares diferentes similares a los ameloblastos, incluida la línea celular de linaje de ameloblastos de ratón (ALC), la línea celular epitelial dental de rata (HAT-7), la línea celular LS8 de ratón 20, la línea celular porcina PABSo-E21 y la línea celular22 de SF2-24 de rata. Sin embargo, la mayoría de estas células han perdido su forma distintiva de células polarizadas en el cultivo 2D.
En el presente estudio hemos recurrido a un sistema de biorreactor de cultivo celular rotatorio (RCCS) para facilitar el crecimiento de células similares a ameloblastos a partir de epitelios de asa cervical cocultivados con progenitores mesenquimales y para superar los desafíos de los sistemas de cultivo 2D, incluido el flujo reducido de nutrientes y los cambios citoesqueléticos debido a la gravedad. Además, el RCCS ha proporcionado nuevas vías para el estudio de las interacciones célula/andamio relacionadas con la ingeniería del tejido periodontal y para examinar los efectos de los mediadores inflamatorios en los tejidos alveolares pulmonares in vitro. En conjunto, los resultados de estos estudios destacan los beneficios de los sistemas de cultivo rotatorio basados en microgravedad para la propagación de epitelios diferenciados y para la evaluación de los efectos ambientales en las células cultivadas in vitro, incluidas las interacciones célula/andamio y la respuesta tisular a las afecciones inflamatorias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos del protocolo para el crecimiento de células en microgravedad incluyen el biorreactor, el andamio, las células utilizadas para el cultivo 3D y el recubrimiento de andamio como medio para inducir la diferenciación celular. El tipo de biorreactor utilizado en nuestros estudios comprende el biorreactor RCCS-4, una modificación reciente del dispositivo de cultivo de tejido cilíndrico giratorio original del Sistema de Cultivo de Células Rotativas (RCCS) desarrollado por la NASA para cultivar células…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los estudios fueron generosamente apoyados por subvenciones del Instituto Nacional de Investigación Dental y Craneofacial (UG3-DE028869 y R01-DE027930).
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au – Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
