Mikro Yerçekiminde Diş ve Solunum Hücre ve Organlarının Yayılımı
Summary
Bu protokol, mikrogravitedeki ameloblast benzeri hücrelerin kültürü ve 3D büyümesi için, uzun ve polarize şekillerini ve emayeye özgü protein ekspresyonunu korumak için bir yöntem sunar. Periodontal mühendislik yapıları kültürü ve mikro yerçekiminde akciğer organları için kültür koşulları da tanımlanmıştır.
Abstract
Yerçekimi, insan hücresi fonksiyonunun, proliferasyonun, sitoiskelet mimarisinin ve oryantasyonunun temel belirleyicilerinden biridir. Döner biyoreaktör sistemleri (RCCS’ler), uzayda meydana gelen yerçekimi kaybını taklit eder ve bunun yerine kültürlenmiş hücrelerin veya dokuların sürekli rotasyonu yoluyla bir mikro yerçekimi ortamı sağlar. Bu RCCS’ler, kesintisiz bir besin kaynağı, büyüme ve transkripsiyon faktörleri ve oksijen sağlar ve hareketsiz 2D (iki boyutlu) hücre veya organ kültürü kaplarındaki yerçekimi kuvvetlerinin bazı eksikliklerini giderir. Bu çalışmada RCCS’leri servikal loop hücreleri ve dental pulpa hücrelerini ameloblast haline getirmek, periodontal progenitör/iskele etkileşimlerini karakterize etmek ve inflamasyonun akciğer alveolleri üzerindeki etkisini belirlemek için birlikte kültürlemek için kullandık. RCCS ortamları, ameloblast benzeri hücrelerin büyümesini kolaylaştırdı, iskele kaplamalarına yanıt olarak periodontal progenitör proliferasyonunu teşvik etti ve enflamatuar değişikliklerin kültürlü akciğer alveolleri üzerindeki etkilerinin değerlendirilmesine izin verdi. Bu makale, çevresel koşulları, materyalleri ve yol boyunca adımları özetlemekte ve kritik yönleri ve deneysel ayrıntıları vurgulamaktadır. Sonuç olarak, RCCS’ler, in vitro hücrelerin kültürüne ve 3D (üç boyutlu) büyümesine hakim olmak ve klasik 2D kültür ortamlarına uygun olmayan hücresel sistemlerin veya etkileşimlerin incelenmesine izin vermek için yenilikçi araçlardır.
Introduction
Yerçekimi, bireysel hücrelerin biyolojisi ve organizmalar içindeki işlevleri de dahil olmak üzere Dünya’daki yaşamın tüm yönlerini etkiler. Hücreler mekanoreseptörler aracılığıyla yerçekimini algılar ve sitoiskelet mimarilerini yeniden yapılandırarak ve hücre bölünmesi 1,2,3’ü değiştirerek yerçekimindeki değişikliklere yanıt verir. Mikro yerçekiminin diğer etkileri arasında sıvı dolu veziküllerdeki hidrostatik basınç, organellerin çökelmesi ve akış ve ısının yüzdürme güdümlü konveksiyonu4 bulunur. Yerçekimi kaybının insan hücreleri ve organları üzerindeki etkisi üzerine yapılan çalışmalar başlangıçta uzay uçuşu görevleri sırasında astronotlar üzerindeki ağırlıksız ortamı simüle etmek için yapılmıştır5. Bununla birlikte, son yıllarda, NASA tarafından mikroyerçekimini simüle etmek için geliştirilen bu 3D biyoreaktör teknolojileri, aksi takdirde 2D kültür sistemlerine uygun olmayan hücre popülasyonlarının kültürü için yeni yaklaşımlar olarak giderek daha alakalı hale gelmektedir.
3D Biyoreaktörler, süspansiyondaki hücreleri büyüterek mikro yerçekimini simüle eder ve böylece sürekli bir “serbest düşüş” etkisi yaratır. Dönen biyoreaktörlerin diğer avantajları arasında organ kültürü sistemlerinde karşılaşılan havaya maruz kalma eksikliği, kayma stresi ve türbülansta azalma ve değişen besin kaynaklarına sürekli maruz kalma sayılabilir. Bir Döner Hücre Kültür Sistemi (RCCS) biyoreaktörü tarafından sağlanan bu dinamik koşullar, uzamsal birlikte lokalizasyonu ve tek hücrelerin agregalara üç boyutlu montajınıdesteklemektedir 6,7.
Önceki çalışmalar, kemik rejenerasyonu8, diş mikrobu kültürü9 ve insan diş folikül hücrelerinin kültürü10 için döner bir biyoreaktörün avantajlarını göstermiştir. RCCS’nin EOE hücre proliferasyonunu ve ameloblastlara farklılaşmasını arttırdığını öne süren bir rapor da vardır11. Bununla birlikte, farklılaşmış hücreler, uzamış morfolojileri veya polarize hücre şekilleri dikkate alınmadan, ameloblastin immünofloresansına ve / veya amelogenin ekspresyonuna dayanan ameloblastlar olarak kabul edildi11 .
NASA tarafından geliştirilen döner duvar damarları (RWV) biyoreaktörüne ek olarak, hücrelerden 3D agregalar üretmek için diğer teknolojiler arasında manyetik levitasyon, rastgele konumlandırma makinesi (RPM) ve klinostat12 bulunmaktadır. Manyetik levitasyon elde etmek için, manyetik nanopartiküllerle etiketlenmiş hücreler harici bir manyetik kuvvet kullanılarak havaya kaldırılır, bu da adiposit yapılarının biyofabrikasyonu için kullanılan iskelesiz 3D yapıların oluşumuna neden olur13,14,15. Mikro yerçekimini simüle etmek için başka bir yaklaşım, klinostat16 adı verilen bir cihazın merkezindeki kümülatif yerçekimi vektörünün iptali ile sonuçlanan iki eksen hakkında eşzamanlı dönüşü kontrol ederek çok yönlü G kuvvetlerinin üretilmesidir. Kemik iliği kök hücreleri bir klinostatta kültürlendiğinde, osteoblast farklılaşmasının baskılanması yoluyla yeni kemik oluşumu inhibe edildi ve bu da mikrogravitenin farklılaştırıcı etkilerinden birini gösterdi16.
Ameloblastların sadık kültürünü kolaylaştırmak için in vitro sistemler, diş minesi doku mühendisliğine doğru büyük bir adım atacaktır17. Ne yazık ki, bu tarihe kadar, ameloblastların kültürü zorlu bir girişim olmuştur18,19. Şimdiye kadar, fare ameloblast soy hücre hattı (ALC), sıçan diş epitel hücre hattı (HAT-7), fare LS8 hücre hattı20, domuz PABSo-E hücre hattı 21 ve sıçan SF2-24 hücre hattı22 dahil olmak üzere beş farklı ameloblast benzerihücre hattı bildirilmiştir. Bununla birlikte, bu hücrelerin çoğunluğu 2D kültüründe ayırt edici polarize hücre şeklini kaybetmiştir.
Bu çalışmada, mezenkimal progenitörlerle birlikte kültürlenmiş servikal döngü epitelinden ameloblast benzeri hücrelerin büyümesini kolaylaştırmak ve yerçekimine bağlı besin akışının azalması ve sitoiskelet değişiklikleri de dahil olmak üzere 2D kültür sistemlerinin zorluklarının üstesinden gelmek için bir Döner Hücre Kültürü Biyoreaktör Sistemine (RCCS) döndük. Ek olarak, RCCS, periodontal doku mühendisliği ile ilgili hücre / iskele etkileşimlerinin incelenmesi ve inflamatuar mediatörlerin akciğer alveoler dokuları üzerindeki etkilerinin in vitro olarak incelenmesi için yeni yollar sağlamıştır. Birlikte, bu çalışmalardan elde edilen sonuçlar, mikrogravite tabanlı döner kültür sistemlerinin farklılaşmış epitelinin yayılması ve hücre / iskele etkileşimleri ve enflamatuar koşullara doku yanıtı da dahil olmak üzere in vitro olarak yetiştirilen hücreler üzerindeki çevresel etkilerin değerlendirilmesi için faydalarını vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikrogravitedeki hücrelerin büyümesi için protokolün kritik adımları arasında biyoreaktör, iskele, 3D kültür için kullanılan hücreler ve hücre farklılaşmasını indüklemek için bir araç olarak iskele kaplaması bulunur. Çalışmalarımızda kullanılan biyoreaktör tipi, NASA tarafından simüle edilmiş mikro yerçekiminde hücreleri büyütmek için geliştirilen orijinal Döner Hücre Kültür Sistemi (RCCS) dönen silindirik doku kültürü cihazının yakın tarihli bir modifikasyonu olan RCCS-4…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çalışmalar, Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü’nden (UG3-DE028869 ve R01-DE027930) gelen hibelerle cömertçe desteklenmiştir.
Materials
| Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientfic | 15240096 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4544 | |
| BGJb Fitton-Jackson Modification media | ThermoFisher Scientfic | 12591 | |
| BIOST PGA scaffold | Synthecon | Custom | Available from the company through a custom order |
| BMP-2 | R&D Systems | 355-BM | |
| BMP-4 | R&D Systems | 314-BP | |
| DMEM Media | Sigma Aldrich | D6429-500mL | |
| FBS | ThermoFisher Scientfic | 16140071 | |
| Fibricol | Advanced Biomatrix | 5133-20mL | |
| Fibronectin | Corning | 354008 | |
| Galanin | Sigma Aldrich | G-0278 | |
| Gelatin disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 500 | |
| Graphene sheets | Advanced Biomatrix | CytoForm 300 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| hFGF | ThermoFisher Scientfic | AA1-155 | |
| Hydroxyapatite disc | Advanced Biomatrix | CytoForm 200 | |
| Il-6 protein | PeproTech | 200-06 | |
| Keratinocyte SFM media (1X) | ThermoFisher Scientfic | 17005042 | |
| Laminin | Corning | 354259 | |
| LRAP peptide | Peptide 2.0 | Custom made sequence: MPLPPHPGSPGYINLSYEVLT PLKWYQSMIRQPPLSPILPEL PLEAWPATDKTKREEVD |
|
| Matrigel | Corning | 354234 | |
| Millipore Nitrocellulose membrane | Merck Millipore | AABP04700 | |
| RCCS Bioreactor | Synthecon | RCCS 4HD | |
| SpongeCol | Advanced Biomatrix | 5135-25EA | |
| Syring valve one way stopcock w/swivel male luer lock | Smiths Medical | MX5-61L | |
| Syringes with needle 3cc | McKESSON | 16-SN3C211 | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientfic | 25200056 |
References
- Horneck, G., et al. Life sciences: microorganisms in the space environment. Science. 225 (4658), 226-228 (1984).
- Helmstetter, C. E. Gravity and the orientation of cell division. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (19), 10195-10198 (1997).
- Bizzarri, M., Monici, M., van Loon, J. J. W. A. How microgravity affects the biology of living systems. BioMed Research International. 2015, 863075 (2015).
- Freed, L. E., Vunjak-Novakovic, G. Spaceflight bioreactor studies of cells and tissues. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 177-195 (2002).
- Walther, I. Space bioreactors and their applications. Advances in Space Biology and Medicine. 8, 197-213 (2002).
- Morabito, C., et al. RCCS bioreactor-based modelled microgravity induces significant changes on in vitro 3D neuroglial cell cultures. BioMed Research International. 2015, 754283 (2015).
- Schwarz, R. P., Goodwin, T. J., Wolf, D. A. Cell culture for three-dimensional modeling in rotating-wall vessels: An application of simulated microgravity. Journal of Tissue Culture Methods. 14 (2), 51-57 (1992).
- Nokhbatolfoghahaei, H., et al. Computational modeling of media flow through perfusion-based bioreactors for bone tissue engineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 234 (12), 1397-1408 (2020).
- Sun, F. -. y., Wang, X. -. m., Li, X. -. y. An innovative membrane bioreactor (MBR) system for simultaneous nitrogen and phosphorus removal. Process Biochemistry. 48 (11), 1749-1756 (2013).
- Steimberg, N., et al. Advanced 3D Models Cultured to Investigate Mesenchymal Stromal Cells of the Human Dental Follicle. Tissue Engineering Methods (Part C). 24 (3), 187-196 (2018).
- Li, P., et al. RCCS enhances EOE cell proliferation and their differentiation into ameloblasts. Molecular Biology Reports. 39 (1), 309-317 (2012).
- Grimm, D., et al. Tissue engineering under microgravity conditions-use of stem cells and specialized cells. Stem Cells and Development. 27 (12), 787-804 (2018).
- Tasoglu, S., et al. Magnetic Levitational Assembly for Living Material Fabrication. Advanced Healthcare Materials. 4 (10), 1469-1476 (2015).
- Sarigil, O., et al. Scaffold-free biofabrication of adipocyte structures with magnetic levitation. Biotechnology and Bioengineering. 118 (3), 1127-1140 (2021).
- Anil-Inevi, M., et al. Biofabrication of in situ Self Assembled 3D Cell Cultures in a Weightlessness Environment Generated using Magnetic Levitation. Scientific Reports. 8 (1), 7239 (2018).
- Nishikawa, M., et al. The effect of simulated microgravity by three-dimensional clinostat on bone tissue engineering. Cell Transplant. 14 (10), 829-835 (2005).
- Pandya, M., Diekwisch, T. G. H. Enamel biomimetics-fiction or future of dentistry. International Journal of Oral Science. 11 (1), 8 (2019).
- Klein, O. D., et al. Meeting report: a hard look at the state of enamel research. International Journal of Oral Science. 9 (11), 3 (2017).
- Liu, H., Yan, X., Pandya, M., Luan, X., Diekwisch, T. G. Daughters of the Enamel Organ: Development, Fate, and Function of the Stratum Intermedium, Stellate Reticulum, and Outer Enamel Epithelium. Stem Cells and Development. 25 (20), 1580-1590 (2016).
- Chen, L. S., Couwenhoven, R. I., Hsu, D., Luo, W., Snead, M. L. Maintenance of amelogenin gene expression by transformed epithelial cells of mouse enamel organ. Archives of Oral Biology. 37 (10), 771-778 (1992).
- DenBesten, P. K., Gao, C., Li, W., Mathews, C. H., Gruenert, D. C. Development and characterization of an SV40 immortalized porcine ameloblast-like cell line. European Journal of Oral Sciences. 107 (4), 276-281 (1999).
- Arakaki, M., et al. Role of epithelial-stem cell interactions during dental cell differentiation. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10590-10601 (2012).
- Au – Chavez, M. G., et al. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. Journal of Visualized Experiments. (87), e51266 (2014).
- Pandya, M., et al. Posttranslational Amelogenin Processing and Changes in Matrix Assembly during Enamel Development. Frontiers in Physiology. 8, 790 (2017).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Differentiation of neural-crest-derived intermediate pluripotent progenitors into committed periodontal populations involves unique molecular signature changes, cohort shifts, and epigenetic modifications. Stem Cells and Development. 20 (1), 39-52 (2011).
- Ahadian, S., et al. Electrical stimulation as a biomimicry tool for regulating muscle cell behavior. Organogenesis. 9 (2), 87-92 (2013).
- Smith, C. E. Cellular and chemical events during enamel maturation. Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 9 (2), 128-161 (1998).
- Pei, M., et al. Bioreactors mediate the effectiveness of tissue engineering scaffolds. The FASEB Journal. 16 (12), 1691-1694 (2002).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Seidel, K., et al. Resolving stem and progenitor cells in the adult mouse incisor through gene co-expression analysis. Elife. 6, (2017).
- Green, H., Rheinwald, J. G., Sun, T. T. Properties of an epithelial cell type in culture: the epidermal keratinocyte and its dependence on products of the fibroblast. Progress in Clinical and Biological Research. 17, 493-500 (1977).
- Green, H. The birth of therapy with cultured cells. Bioessays. 30 (9), 897-903 (2008).
- Zeichner-David, M., et al. Control of ameloblast differentiation. International Journal of Developmental Biology. 39 (1), 69-92 (1995).
- Bei, M., Stowell, S., Maas, R. Msx2 controls ameloblast terminal differentiation. Developmental Dynamics. 231 (4), 758-765 (2004).
- Dangaria, S. J., Ito, Y., Luan, X., Diekwisch, T. G. Successful periodontal ligament regeneration by periodontal progenitor preseeding on natural tooth root surfaces. Stem Cells and Development. 20 (10), 1659-1668 (2011).
- Del Moral, P. M., Warburton, D. Explant culture of mouse embryonic whole lung, isolated epithelium, or mesenchyme under chemically defined conditions as a system to evaluate the molecular mechanism of branching morphogenesis and cellular differentiation. Methods in Molecular Biology. 633, 71-79 (2010).
- Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro. Laboratory Investigation. 84 (6), 736-752 (2004).
- Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. Journal of Biomedicine and Biotechnolog. 2011, 852419 (2011).
- Kuppan, P., Sethuraman, S., Krishnan, U. M. In vitro co-culture of epithelial cells and smooth muscle cells on aligned nanofibrous scaffolds. Materials Science and Engineering: C. 81, 191-205 (2017).
- Navran, S. The application of low shear modeled microgravity to 3-D cell biology and tissue engineering. Biotechnology Annual Review. 14, 275-296 (2008).
