Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural
Summary
Aquí informamos un método de bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para biofabricar tejidos neurales para estudiar la funcionalidad de los astrocitos en el sistema nervioso central y los mecanismos que involucran a las células gliales en enfermedades y tratamientos neurológicos.
Abstract
Los astrocitos son células gliales con un papel esencial en el sistema nervioso central (SNC), incluyendo el soporte neuronal y la funcionalidad. Estas células también responden a las lesiones neuronales y actúan para proteger el tejido de eventos degenerativos. Los estudios in vitro de la funcionalidad de los astrocitos son importantes para dilucidar los mecanismos implicados en tales eventos y contribuir al desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos. Este protocolo describe un método para biofabricar una estructura de tejido de tipo neural rica en astrocitos mediante bioimpresión 3D de biotinta cargada de astrocitos. En este trabajo se utilizó una bioimpresora 3D basada en extrusión, y se extrajeron astrocitos de las cortezas cerebrales de los cachorros de ratones C57Bl / 6. La biotinta se preparó mezclando astrocitos corticales de hasta el pasaje 3 a una solución de biomaterial compuesta de gelatina, gelatina-metacriloil (GelMA) y fibrinógeno, complementada con laminina, que presentaba condiciones óptimas de bioimpresión. Las condiciones de bioimpresión 3D minimizaron el estrés celular, contribuyendo a la alta viabilidad de los astrocitos durante el proceso, en el que el 74,08% ± el 1,33% de las células eran viables justo después de la bioimpresión. Después de 1 semana de incubación, la viabilidad de los astrocitos aumentó significativamente a 83.54% ± 3.00%, lo que indica que la construcción 3D representa un microambiente adecuado para el crecimiento celular. La composición del biomaterial permitió la unión celular y estimuló el comportamiento astrocítico, con células que expresan el marcador específico de astrocitos glial de proteína ácida fibrilar (GFAP) y poseen la morfología astrocítica típica. Este protocolo reproducible proporciona un método valioso para biofabricar tejido neural 3D rico en astrocitos que se asemeja al microambiente nativo de las células, útil para los investigadores que tienen como objetivo comprender la funcionalidad de los astrocitos y su relación con los mecanismos involucrados en las enfermedades neurológicas.
Introduction
Los astrocitos son el tipo de célula más abundante en el Sistema Nervioso Central (SNC) y juegan un papel clave en la homeostasis cerebral. Además de soportar el apoyo neuronal, los astrocitos son responsables de modular la absorción de neurotransmisores, mantener la integridad de la barrera hematoencefálica y regular la sinaptogénesis neuronal1,2. Los astrocitos también tienen un papel esencial en la inflamación del SNC, respondiendo a lesiones en el cerebro en un proceso que conduce a la reactividad astrociátrica o astrogliosis reactiva3,4,formando una cicatriz glial que impide la exposición del tejido sano a agentes degenerativos5. Este evento resulta en cambios en la expresión génica, morfología y función de los astrocitos6,7. Por lo tanto, los estudios que involucran la funcionalidad de los astrocitos son útiles para el desarrollo de terapias para tratar trastornos neurológicos.
Los modelos in vitro son cruciales para estudiar los mecanismos relacionados con las lesiones neurológicas, y aunque se ha establecido un aislamiento exitoso y un cultivo bidimensional (2D) de astrocitos corticales8,este modelo no proporciona un entorno realista que imite el comportamiento de las células nativas y reproduzca la complejidad del cerebro9 . En condición 2D, el pobre soporte mecánico y bioquímico, las bajas interacciones célula-célula y célula-matriz, y el aplanamiento celular que conduce a la ausencia de polaridad basal-apical, afectan la dinámica de señalización celular y los resultados experimentales que conducen a la alteración de la morfología celular y la expresión génica, que comprometen la respuesta a los tratamientos10. Por lo tanto, es crucial desarrollar alternativas que proporcionen un entorno neuronal más realista, con el objetivo de traducir los resultados a la clínica.
El cultivo celular tridimensional (3D) representa un modelo más avanzado que recapitula con mayor fidelidad las características de órganos y tejidos, incluido el SNC11. En cuanto al cultivo glial, los modelos 3D contribuyen al mantenimiento de la morfología de los astrocitos, la polaridad basal-apical celular y la señalización celular12,13. La tecnología de bioimpresión 3D surgió como una poderosa herramienta para biofabricar tejidos vivos 3D de manera controlada mediante el uso de células y biomateriales para recrear la estructura y las propiedades de los tejidos nativos. El uso de esta tecnología ha supuesto una mejora sustancial de la predicción de resultados y ha contribuido a la medicina regenerativa aplicada al SNC14,15,16.
El protocolo descrito aquí detalla el aislamiento y cultivo de astrocitos corticales. El protocolo también detalla un método reproducible para bioimprimir astrocitos incrustados en gelatina / gelatina metacriloilo (GelMA) / fibrinógeno, complementado con laminina. En este trabajo, se utilizó una bioimpresora basada en extrusión para imprimir la composición del biomaterial que contiene astrocitos corticales a una densidad de 1 x 106 células/ ml. El estrés de cizallamiento de bioimpresión se minimizó mediante el control de la velocidad de impresión, y los astrocitos mostraron una alta viabilidad después del proceso. Los constructos bioimpresos se cultivaron durante 1 semana, y los astrocitos pudieron propagarse, adherirse y sobrevivir dentro del hidrogel, manteniendo la morfología astrocítica y expresando un marcador específico de proteína ácida fibrilar glial (GFAP)4.
Este procedimiento es compatible con bioimpresoras basadas en extrusión accionadas por pistón y se puede utilizar para bioimprimir astrocitos derivados de diferentes fuentes. El modelo bioimpreso en 3D propuesto aquí es adecuado para una amplia gama de aplicaciones de ingeniería neuronal, como los estudios de los mecanismos involucrados en la funcionalidad de los astrocitos en tejidos sanos y la comprensión de la progresión de las patologías neurológicas y el desarrollo de tratamientos.
Protocol
Representative Results
Discussion
La tecnología de bioimpresión 3D ha surgido como una alternativa de biofabricación que permite la ingeniería de construcciones refinadas que estructural y fisiológicamente se asemejan a tejidos nativos22,incluido el cerebro23. La biofabricación de tejidos neurales permite el modelado de microambientes nativos in vitro, siendo una herramienta importante para comprender los mecanismos celulares y moleculares asociados con el desarrollo y tratamiento de muchas e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP), números de subvención 2018/23039-3 y 2018/12605-8; Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq), números de subvención 465656/2014-5 y 309679/2018-4; y Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES), código financiero 001.
Materials
| 3D Bioprinter | 3D Biotechnology Solutions | Extrusion-based bioprinter | |
| Blunt-tip forceps | Integra Miltex | 6–30 | Forceps for brain dissection previously sterilized |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 9048-46-8 | Protease free, fatty acid free, essentially globulin free |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | |
| Cell culture flask | Fisher Scientific | 156340 | Culture flask T25 |
| Cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | Cell strainer 40 µm |
| Confocal microscope | Leica | Confocal TCS SP8 microscopy coupled with an Olympus FluoView 300 confocal system | |
| Conical tubes | Thermo Scientific | 339651, 339652 | Sterile tubes of 15 mL and 50 mL |
| DAPI | Abcam | ab224589 | DAPI staining solution |
| DMEM/F12 | Gibco; Life Technologies Corporation | 12500062 | DMEM/F-12 50/50, 1X (Dulbecco's Mod. Of Eagle's Medium/Ham's F12 50/50 Mix) with L-glutamine |
| Dyalisis tubing | Sigma-Aldrich | D9527 | Molecular weight cut-off = 14 kDa |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-15-5 | Reagent grade |
| Fetal Bovine Serum | Gibco; Life Technologies Corporation | 12657011 | Research Grade |
| Fibrinogen | Sigma-Aldrich | 9001-32-5 | Fibrinogen cristalline powder from bovine plasma |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | 9000-70-8 | Gelatin powder from porcine skin |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 56-40-6 | Glycine powder |
| Hanks Buffered Salt Solution (HBSS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 14175095 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | 56-85-9 | L-Glutamine crystalline powder |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | Laminin 1-2 mg/mL L in 50 mM Tris-HCl |
| Live dead kit cell imaging kit | Thermo Scientific | R37601 | Green fluorescence in live cells (ex/em 488 nm/515 nm). Red fluorescence in dead cells (ex/em 570 nm/602 nm) |
| Methacrylic anhydride | Sigma-Aldrich | 760-93-0 | For GelMA preparation |
| Microtubes | Corning Incorporated | MCT-150-C | Microtubes of 1,5 mL |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Needle 22G | Fisher Scientific | NC1362045 | Sterile blunt needle |
| Operating scissor | Integra Miltex | 05–02 | Sharp scissor for brain dissection previously sterilized |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde powder |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco; Life Technologies Corporation | 15070063 | Pen Strep (5,000 Units/ mL Penicillin; 5,000 ug/mL Streptomycin) |
| Petri dish | Corning Incorporated | 430591, 430588 | Sterile petri dishes of 35 and 100 mm |
| Phalloidin | Abcam | ab176753 | iFluor 488 reagent |
| Photoinitiator | Sigma-Aldrich | 106797-53-9 | 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone |
| Phosphate buffer saline (PBS) | Gibco; Life Technologies Corporation | 10010023 | PBS 1 x, culture grade, no calcium, no magnesium |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Poly-L-lysine hydrobromide mol wt 30,000-70,000 |
| Primary antobody | Abcam | ab4674 | Chicken polyclonal to GFAP |
| Secondary antibody | Abcam | ab150176 | Alexa fluor 594 anti-chicken |
| Spatula | Miltex | V973-70 | Number 24 cement spatula previously sterilized |
| Stereomicroscope | Fisherbrand | 3000038 | Microscope for brain dissection |
| Syringe 5 mL | BD | 1222C84 | Sterile syringe |
| Syringe filter 2 µm | Fisher Scientific | 09-740-105 | Polypropylene filter for sterilization |
| Thrombin | Sigma-Aldrich | 9002–04-4 | Thrombin cristalline powder from bovine plasma |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Laboratory grade |
| Trypsin-EDTA | Gibco; Life Technologies Corporation | 15400054 | Trypsin no phenol red 1 x diluted in PBS |
| Versene solution | Gibco; Life Technologies Corporation | 15040066 | Versene Solution (0.48 mM) formulated as 0.2 g EDTA(Na4) per liter of PBS |
| Well plate | Thermo Scientific | 144530 | Sterile 24-well plate |
References
- Di, L., Mannelli, C., Cuzzocrea, S. Astrocytes: Role and functions in brain pathologies. Frontiers in Pharmacology. 10, 1114 (2019).
- Kimelberg, H. K., Nedergaard, M. Functions of astrocytes and their potential as therapeutic targets. Neurotherapeutics. 7 (4), 338-353 (2010).
- Giovannoni, F., Quintana, F. J. The role of astrocytes in CNS inflammation. Trends in Immunology. 41 (9), 805-819 (2020).
- Escartin, C., et al. Reactive astrocyte nomenclature, definitions, and future directions. Nature Neuroscience. 24 (3), 312-325 (2021).
- Carson, M. J., Thrash, J. C., Walter, B. The cellular response in neuroinflammation: The role of leukocytes, microglia and astrocytes in neuronal death and survival. Clinical Neuroscience Research. 6 (5), 237-245 (2006).
- Liddelow, S. A., Barres, B. A. Reactive astrocytes: Production, function, and therapeutic potential. Immunity. 46 (6), 957-967 (2017).
- Clarke, L. E., et al. Normal aging induces A1-like astrocyte reactivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unied States of America. 115 (8), 1896-1905 (2018).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (71), e50079 (2013).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
- Knight, E., Przyborski, S. Advances in 3D cell culture technologies enabling tissue-like structures to be created in vitro. Journal of Anatomy. 227 (6), 746-756 (2015).
- Zhuang, P., Sun, A. X., An, J., Chua, C. K., Chew, S. Y. 3D neural tissue models: From spheroids to bioprinting. Biomaterials. 154, 113-133 (2018).
- Balasubramanian, S., Packard, J. A., Leach, J. B., Powell, E. M. Three-dimensional environment sustains morphological heterogeneity and promotes phenotypic progression. Tissue Engineering. Part A. 22 (11-12), 885-898 (2016).
- Watson, P. M. D., Kavanagh, E., Allenby, G., Vassey, M. Bioengineered 3D glial cell culture systems and applications for neurodegeneration and neuroinflammation. SLAS Discovery. 22 (5), 583-601 (2017).
- Li, Y. E., Jodat, Y. A., Samanipour, R., Zorzi, G., Zhu, K. Toward a neurospheroid niche model: optimizing embedded 3D bioprinting for fabrication of neurospheroid brain-like co-culture constructs. Biofabrication. , (2020).
- Zhou, X., et al. Three-dimensional-bioprinted dopamine-based matrix for promoting neural regeneration. ACS Applied Materials & Interfaces. 10 (10), 8993-9001 (2018).
- de la Vega, L., et al. 3D bioprinting human induced pluripotent stem cell-derived neural tissues using a novel lab-on-a-printer technology. Applied Sciences. 8 (12), 2414 (2018).
- Scheraga, H. A. The thrombin-fibrinogen interaction. Biophysical Chemistry. 112 (2-3), 117-130 (2004).
- Ariens, R. A. S., Lai, T., Weisel, J. W., Greenberg, C. S., Grant, P. J. Role of factor XIII in fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms. Blood. 100 (3), 743-754 (2002).
- Yue, K., et al. Synthesis, properties, and biomedical applications of Gelatin Methacryloyl (GelMA) hydrogels. Biomaterials. 73, 254-271 (2015).
- de Melo, B. A. G., et al. Strategies to use fibrinogen as bioink for 3D bioprinting fibrin-based soft and hard tissues. Acta Biomaterialia. 117, 60-76 (2020).
- Wang, X., et al. Gelatin-based hydrogels for organ 3D bioprinting. Polymers (Basel). 9 (9), 401 (2017).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Naure. Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- de la Vega, L., Lee, C., Sharma, R., Amereh, M., Willerth, S. M. 3D bioprinting models of neural tissues: The current state of the field and future directions. Brain Research Bulletin. 150, 240-249 (2019).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Hanu, R., et al. Monocarboxylic acid transporters, MCT1 and MCT2, in cortical astrocytes in vitro and in vivo. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 278 (5), 921-930 (2000).
- Liu, R., Wang, Z. h., Gou, L., Xu, H. A cortical astrocyte subpopulation inhibits axon growth in vitro and in vivo. Molecular Medicine Reports. 12 (2), 2598-2606 (2015).
- Winter, C. C., Cullen, D. K., Donnell, J. C. O., Song, Y. J., Hernandez, N. S. Three-dimensional tissue engineered aligned astrocyte networks to recapitulate developmental mechanisms and facilitate nervous system regeneration. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), e55848 (2018).
- East, E., Golding, J. P., Phillips, J. B. A versatile 3D culture model facilitates monitoring of astrocytes undergoing reactive gliosis. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 3 (8), 634-646 (2009).
- Hawkinsn, B. T., Grego, S., Sellgren, K. L. Three-dimensional culture conditions differentially affect astrocyte modulation of brain endothelial barrier function in response to transforming growth factor B1. Brain Research. 1608, 167-176 (2015).
- Abelseth, E., et al. 3D printing of neural tissues derived from human induced pluripotent stem cells using a fibrin-based bioink. ACS Biomaterials Science and Engineering. 5 (1), 234-243 (2019).
- Filippo, T. R. M., et al. CXCL12 N-terminal end is sufficient to induce chemotaxis and proliferation of neural stem/progenitor cells. Stem Cell Research. 11 (2), 913-925 (2013).
- Galindo, L. T., et al. Chondroitin sulfate impairs neural stem cell migration through ROCK activation. Molecular Neurobiology. 55 (4), 3185-3195 (2018).
- Groll, J., et al. A definition of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Biofabrication. 11 (1), 03001 (2018).
- Kyle, S., Jessop, Z. M., Al-sabah, A., Whitaker, I. S. Printability of candidate biomaterials for extrusion-based 3D printing: state-of-the-art. Advanced Healthcare Materials. 6 (16), (2017).
- Blaeser, A., et al. Controlling shear stress in 3D bioprinting is a key factor to balance printing resolution and stem cell integrity. Advanced Healthcare Materials. 5 (3), 326-333 (2016).
- Miyawaki, O., Omote, C., Matsuhira, K. Thermodynamic analysis of sol-gel transition of gelatin in terms of water activity in various solutions. Biopolymers. 103 (12), 685-691 (2015).
- Shirahama, H., Lee, B. H., Tan, L. P., Cho, N. Precise tuning of facile one-pot Gelatin Methacryloyl (GelMA) synthesis. Science Reports. 6, 31036 (2016).
- Antonovaite, N., Beekmans, S. V., Hol, E. M., Wadman, W. J., Iannuzzi, D. Regional variations in stiffness in live mouse brain tissue determined by depth-controlled indentation mapping. Science Reports. 8 (1), 12517 (2018).
- Iwashita, M., et al. Comparative analysis of brain stiffness among amniotes using glyoxal fixation and atomic force microscopy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 574619 (2020).
- Guimarães, C. F., Gasperini, L., Marques, A. P., Reis, R. L. The stiffness of living tissues and its implications for tissue engineering. Nature Reviews. 5, 351-370 (2010).
- Ye, W., et al. 3D printing of gelatin methacrylate-based nerve guidance conduits with multiple channels. Materials and Design. 192, 108757 (2020).
- Wu, Y., et al. The influence of the stiffness of GelMA substrate on the outgrowth of PC12 cells. Bioscience Reports. 39 (1), 1-9 (2019).
- Edgar, J. M., Robinson, M., Willerth, S. M. Fibrin hydrogels induce mixed dorsal/ventral spinal neuron identities during differentiation of human induced pluripotent stem cells. Acta Biomaterialia. 51, 237-245 (2017).
- Arulmoli, J., et al. Combination scaffolds of salmon fibrin, hyaluronic acid, and laminin for human neural stem cell and vascular tissue engineering. Acta Biomaterialia. 43, 122-138 (2016).
- Brenner, M. Role of GFAP in CNS Injuries. Neuroscience. Letters. 565, 7-13 (2014).
