Fibroblast avledet menneskekonstruert bindevev for screeningapplikasjoner

Summary

Presentert her er en protokoll for å generere konstruert bindevev for en parallell kultur på 48 vev i en multi-brønn plate med doble poler, egnet for mekanistiske studier, sykdomsmodellering og screening applikasjoner. Protokollen er kompatibel med fibroblaster fra forskjellige organer og arter og eksemplifiseres her med humane primære hjertefibroblaster.

Abstract

Fibroblaster er fenotypisk svært dynamiske celler, som raskt transdifferenterer til myofibroblaster som svar på biokjemiske og biomekaniske stimuli. Den nåværende forståelsen av fibrotiske prosesser, inkludert hjertefibrose, forblir dårlig, noe som hemmer utviklingen av nye antifibrotiske terapier. Kontrollerbare og pålitelige menneskelige modellsystemer er avgjørende for en bedre forståelse av fibrosepatologi. Dette er en svært reproduserbar og skalerbar protokoll for å generere konstruert bindevev (ECT) i en 48-brønns støpeplate for å lette studier av fibroblaster og patofysiologien til fibrotisk vev i et 3-dimensjonalt (3D) miljø. ECT genereres rundt polene med justerbar stivhet, noe som muliggjør studier under en definert biomekanisk belastning. Under de definerte lasteforholdene kan fenotypiske tilpasninger kontrollert av cellematriseinteraksjoner studeres. Parallell testing er mulig i 48-brønnsformatet med mulighet for tidsforløpanalyse av flere parametere, for eksempel vevskomprimering og sammentrekning mot lasten. Fra disse parametrene kan biomekaniske egenskaper som vevstivhet og elastisitet studeres.

Introduction

Et stort hinder i studiet av fibrotiske sykdommer er mangelen på representative menneskelige 3D-vevsmodeller som gir innsikt i oppførselen til fibroblaster og deres patologiske derivater. For å studere fibrotiske prosesser er standard 2D-kultursystemer suboptimale siden isolerte fibroblaster transdifferentiate raskt til α-glatt muskel actin (SMA)-uttrykke myofibroblaster når dyrket på ikke-kompatible 2D-substrater1,2,3. Dermed gjenspeiler fibroblaster i standard 2D-kultur ikke en vanlig “sunn” vevsfenotype3,4,5,6. Kulturer på bøyelige substrater har blitt introdusert for å simulere ikke-fibrotiske (10 kPa) og fibrotiske (35 kPa) ^{vevsmiljøer7}, men disse mangler den tredje dimensjonen, noe som er svært viktig med hensyn til patofysiologi. Vevsteknikk gir muligheten til å overvinne denne begrensningen ved å tillate fibroblastkultur i en definert og eksperimentelt justerbar ekstracellulær matrise (ECM)-kontekst, for eksempel ved endringer i cellulæriteten, ECM-sammensetningen og ECM-konsentrasjonen, som alle kan bestemme vevbiomekanikken.

Ulike 3D-modeller har blitt generert ved hjelp av fibroblaster. Flytende plater og mikrosfærer var blant de første og viser at kollagen er ombygd og komprimert på en tidsavhengig måte. Fibroblaster utøver trekkraft krefter på kollagen fibrils, en prosess som kan lettes ved tilsetning av pro-fibrotiske midler som transformering vekstfaktor-beta 1 (TGF-β1)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16}. Fritt flytende kulturer tillater imidlertid ikke kontrollert ekstern lasting og utgjør derfor kontinuerlig krympende eller komprimerende modeller. Arklignende konstruert vev åpnet muligheten for å studere homeostatisk regulering av biomekaniske egenskaper av vev, nemlig gjennom uni, bi, multiaxial eller syklisk belastningstesting^17,18,19,20. Disse modellene har blitt brukt, for eksempel for å demonstrere påvirkning av cellenummeret på vevsstivheten, som ble funnet å korrelere positivt med cytoskjelettintegritet og actomyosin cytoskeleton-kontraktilitet.^18,19. Det er imidlertid viktig å merke seg at kraft-til-belastning-konverteringer er komplisert av den ikke-ensartede vevsdeformasjonen rundt klemmepunkter av krafttransdusere og ankerpunkter. Denne iboende begrensningen kan omgås av hundeben eller ringformet vev, noe som gir litt vevshåndhevelse ved ankerpunkter^21,22,23. Ringformet vev kan tilberedes ved å distribuere en celle-kollagen hydrogel i ringformede former. Når hydrogelen komprimeres, dannes et vev rundt den ukomprimerbare indre stangen i formen, noe som gir motstand for ytterligere vevskontraksjon.^24,25,26,27. Etter innledende og typisk maksimal komprimering kan vev også overføres til justerbare avstandsstykker for ytterligere å begrense sirkulær ECT ved en definert vevslengde^{3,24,25,26,27,28,29,30}. Biofysiske egenskaper kan vurderes i standard horisontale eller vertikale belastningsspenningsenheter med passende veieceller under enveis eller dynamisk stamme³. Siden vevet i stor grad har en jevn sirkulær struktur og kan holdes på stenger/kroker (forankringspunkter og/eller krafttransdusere), selv om disse fortsatt kan omslutte kompresjonsområder rundt lastestengene, gir dette formatet en mer jevn belastningsvariasjon sammenlignet med klemming.³. Videre fremkaller forankret vev en bipolar celleform, og cellene tilpasser seg vevskreftene ved forlengelse langs kraftlinjer som fremmer anisotrop trekkraft.^{31,32,33,34,35,36}. Vi har tidligere brukt ringformet ECT fra rotte og humane hjertefibroblaster (CF) rundt en enkelt stiv pol i funksjonelle stressstammeforsøk og utført gevinst og tap av funksjonsstudier ved å bruke viralt transduced fibroblaster^24,25,26 farmakologiske studier³⁷. Videre kunne vi identifisere kjønnsforskjeller i CF-mediert fibrose i ECT-modellen²⁷.

Følgende protokoll for generering av menneskelig ECT, eksemplifisert med primær menneskelig CF oppnådd som kryopreservert CF fra kommersielle leverandører (se Tabell over materialer), kombinerer fordelene med ringformet vev med en enkel og rask måte å produsere makroskopisk vev for en 48-brønns plattform designet for parallell testing av høyt innhold.

Det er viktig at ECT-modellen ikke er begrenset til en bestemt fibroblasttype, med dokumentert bruk i utredning av andre fibroblaster, for eksempel hudfibroblaster38,39. Videre fungerer fibroblaster fra pasientens biopsier like bra, og valget av fibroblaster avhenger til slutt av det vitenskapelige spørsmålet som skal tas opp.

Plattformen som brukes til generering av ECT beskrevet i denne protokollen er en kommersielt tilgjengelig 48-brønns 3D-celle/ vevskulturplate (figur 1A). Metodene for fremstilling, dyrking og overvåking av ECT-dannelse og funksjon under en definert geometri og mekanisk belastning ved hjelp av 48-brønnsplaten er beskrevet. Den dannede ECT holdes av integrerte fleksible poler, og den mekaniske belastningen kan finjusteres i henhold til det endelige formålet ved å bruke poler med forskjellig hardhet (Shore A-verdi 36-89), som påvirker bøyestivhetene. Poler med en landVerdi på 46 anbefales. Protokollen er i tillegg kompatibel med en tidligere beskrevet tilpasset sirkulær form, hvor ECT holdes rundt en enkelt stiv ^stang37. Dimensjonene til denne formen er gitt i figur 1B.

Figur 1: Skjematisk representasjon av støpeformer. (A) Teknisk tegning og dimensjoner av en støpeform med to fleksible poler. Formen består av en indre omkrets avgrenset av en kort vegg som holder doble holdestenger på formens hoveddel. De fleksible polene har fri horisontal avstand til hverandre og er koblet til basen. Formen gir mulighet for 180 μL støpevolum. Brønnen til hver form tillater en volumkapasitet på minst 600 μL kulturmedier. Ulike materialsammensetninger kan brukes til å produsere poler med spesifikke stivheter (f.eks. TM5MED-TM9MED). (B) Teknisk tegning og dimensjoner av en ringformet form med en enkelt stiv stang. Dette er en alternativ form med distinkt geometri og mekanisk miljø, som kan brukes med ECT ^{støpeprotokoll37}. Den ringformede muggmonteringsmetoden ble tilpasset fra publiserte større ^{formater28,41}. Kort sagt inkluderer metoden (1) avtrykk av polytetrafluoretylen (PTFE) støpeavstandsstykker (8 mm diameter) i polydimetylsiloksan (PDMS, silikon) helles i glassretter (diameter 60 mm), og (2) fester en PDMS-stangholder (1,5 mm diameter) konsentrisk innsiden av det dannede hule hulrommet, som tjener til å (3) holde en avtagbar pol (4 mm diameter silikonrør). Den hule plass resulterende tillater 180 μL av støpevolum. Hver glassfat kan komportere flere trykte former (eksemplarisk vist med 5 former) og har kapasitet til opptil 5 ml kulturmedium. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Protocol

Alle trinn må utføres i en klasse II biosikkerhets hetter installert i laboratorier under inneslutningsnivå 1. Avhengig av lokale forskrifter og type manipulasjoner som skal utføres, for eksempel viralmediert genoverføring, må inneslutningsnivået økes til biosikkerhetsnivå 2 eller 3. Alle kulturer opprettholdes ved 37 °C i en cellekulturinkubator med en fuktet atmosfære på 5 % CO2 i luften. Vær oppmerksom på at volumene (trinn 1 og 2) er gitt for en T75 cellekulturflaske. Juster volumene til fors…

Representative Results

ECT når rundt 95 % komprimering sammenlignet med det første celle-kollagenhydrgelvolumet i løpet av de første 24 t. Vevskomprimering og sammentrekning under kontrollforhold og i nærvær av FCS følger noen timer etter støping og øker spesielt opp til dag 5 (figur 5A). Pole deflection kan ytterligere øke i løpet av de neste 15 dagene (20 dager var den lengste tiden testet). Størrelsen på stangavbøyning avhenger av celletype, celletilstand og celle- og vevskulturforhold. Vanligvis …

Discussion

Den presenterte protokollen beskriver genereringen av ECT fra primært menneskelig CF, som gjør det mulig å studere den mekaniske effekten av disse cellene på deres ekstracellulære matrisemiljø og omvendt.

Fibroblaster må utvides for å gi tilstrekkelige celler for de planlagte ECT-eksperimentene (0,75 x ¹⁰⁶ celler / ECT). For best mulig reproduserbarhet anbefales det å pre-kultur frosne eller vevsavledede fibroblaster i 2D-monolayerkultur for en standardisert varighet opptil…

Materials

Cell culture reagents:
Accutase Solution	Merk Millipore	SCR005
Dissociation reagent – TrypLE Express	Gibco	12604013
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder, high glucose	Gibco	12100061
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+	Gibco	14190144
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3132
FBM Fibroblast Growth Basal Medium	Lonza	CC-3131
FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, Supplements and Growth Factors	Lonza	CC-4126
Fibroblast Growth Medium 3 KIT	PromoCell	C-23130
Fibroblast Basal Medium 3	PromoCell	C-23230
Growth Medium 3 SupplementPack	PromoCell	C-39350
Penicillin (10000 U/mL)/ Streptomycin (10000 μL/mL)	Gibco	15140122
Sodium hydroxide solution (NaOH) 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770-100ML
Cell sources:
Normal human cardiac fibroblasts from the ventricle (NHCF-V)	Lonza	CC-2904
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-c)	PromoCell	C-12375
Human Cardiac Fibroblasts (HCF-p)	PromoCell	C-12377
Primary human foreskin fibroblasts-1 (HFF-1)	ATCC	SCRC- 1041
Collagen sourses:
Collagen Type I (bovine) in 0.01 M HCl	LLC Collagen Solutions	FS22024	6-7 mg/mL
Collagen Type I (rat tail) in 0.02 M HCl	Corning	354236	~4 mg/mL
Drugs:
Latrunculin-A (Lat-A)	Enzo Life Sciences	BML-T119-0100
Plastic ware:
Cell culture plastic ware	Sarstedt and Starlab
Mesh cell strainer (Nylon, pore size 40 μm)	Falcon	352340
myrPlate-uniform	myriamed GmbH	TM5 med
Serological pipettes wide opening, sterile (10 mL)	Corning	07-200-619
Specific instruments:
Bi-telecentric CORE lens for 1/2″ detectors	OptoEngineering	TCCR12096
Area scan camera Basler ace acA4024	Basler	107404