Vi giver en detaljeret beskrivelse af de trin, der kræves for at samle en højtrykscelle, oprette og registrere NMR-eksperimenter med højtryk og endelig analysere både topintensitets- og kemikalieskift under tryk. Disse eksperimenter kan give værdifuld indsigt i foldeveje og strukturel stabilitet af proteiner.
Højtryk er en velkendt forstyrrelsesmetode, der kan bruges til at destabilisere kugleformede proteiner og adskille proteinkomplekser på en reversibel måde. Hydrostatisk tryk driver termodynamisk ligevægt mod staten (r) med den lavere molar volumen. Stigende tryk giver derfor mulighed for at finjustere stabiliteten af kugleformede proteiner og oligomeriseringsekvilibri af proteinkomplekser. Nmr-eksperimenter med højt tryk giver mulighed for en detaljeret karakterisering af de faktorer, der styrer stabiliteten af kugleproteiner, deres foldemekanismer og oligomeriseringsmekanismer ved at kombinere trykforstyrrelsens finstabilitetsevne og den stedopløsning, der tilbydes ved løsning NMR-spektroskopi. Her præsenterer vi en protokol til sonde den lokale folde stabilitet af et protein via et sæt af 2D 1H-15N eksperimenter registreret fra 1 bar til 2,5 kbar. De trin, der kræves til erhvervelse og analyse af sådanne eksperimenter, illustreres med data, der er erhvervet på RRM2-domænet for hnRNPA1.
Det har længe været anerkendt, at højere energi, tyndt befolkede kropsbygningstilstande af proteiner og proteinkomplekser spiller en central rolle i mange biologiske veje1,2,3. Takket være eksperimenter baseret på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5og dark-state exchange saturation transfer (DEST)6 pulssekvenser (blandt andre) er løsning NMR-spektroskopi opstået som en valgfri metode til karakterisering af forbigående kropsbygningstilstande7. Sammen med disse eksperimenter, forstyrrelser såsom temperatur, pH, eller kemiske denaturanter kan indføres for at øge den relative befolkning af højere energi kropsbygning substates. Tilsvarende kan protein ekvilibri også forstyrres ved at anvende højt hydrostatisk tryk. Afhængigt af størrelsen af volumenændringen i forbindelse med de tilsvarende kropslige ændringer kan en stigning i trykket med et par hundrede til et par tusinde barer betydeligt stabilisere en højere energitilstand eller få et protein til helt at udfolde sig8,9,10. Protein NMR-spektre udviser typisk to typer ændringer med hydrostatisk tryk: (i) ændringer i kemisk skift og (ii) ændringer i spidsbelastningsintensiteten. Ændringer i kemiske skift afspejler ændringer i proteinoverfladen-vand-grænsefladen og/eller den lokale kompression af proteinstrukturen på en hurtig tidsskala (i forhold til NMR-tidsskalaen)11. Krydsfarver , der udviser store ikke-lineære kemiske skift trykafhængighed, kan indikere tilstedeværelsen af højere energikonformationstilstande12,13. På den anden side peger ændringer i spids intensitet på større kropslige overgange på en langsom tidsskala, såsom ændringer i foldede / udfoldede tilstandspopulationer. Tilstedeværelsen af sammenklappelige mellemprodukter eller højere energitilstande kan påvises fra store variationer i volumenændringens størrelse ved udfoldning målt for forskellige restkoncentrationer af et givet protein14,15,16,17. Baseret på vores erfaring udviser selv små proteiner, der typisk er klassificeret som tostatsmapper, ikke-ensartede reaktioner på tryk, hvilket giver nyttige oplysninger om deres lokale foldestabilitet. Beskrevet her er en protokol for erhvervelse og analyse af amide peak intensitet og 1H kemiske skift trykafhængighed, ved hjælp af som model protein den isolerede RNA anerkendelse motiv 2 (RRM2) af heterogene nukleare ribonucleoprotein A1 (hnRNPA1).
Denne undersøgelse beskriver en protokol implementeret til sonde protein strukturelle og termodynamik reaktioner på trykforstyrrelse. De højtryksforsøg, der er registreret her på RRM2, viser, at store variationer i ΔVU-værdier, der indikerer ikke-fuldt samarbejdsvillig udfoldning, kan findes i et relativt lille enkelt domæneprotein. Et lignende billede fremgår af analysen af 1H kemiske skift ændringer under pres. Det skal bemærkes, at Kalbitzer og kolleger har påvist, at der kan foretage…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af midler fra Roy J. Carver Charitable Trust til Julien Roche. Vi takker JD Levengood og B. S. Tolbert for venligt at give RRM2 prøve.
Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |