Vi gir en detaljert beskrivelse av trinnene som kreves for å montere en høytrykkscelle, sette opp og registrere høytrykks NMR-eksperimenter, og til slutt analysere både toppintensitet og kjemiske skiftendringer under trykk. Disse eksperimentene kan gi verdifull innsikt i foldeveiene og strukturell stabilitet av proteiner.
Høyt trykk er en velkjent perturbasjonsmetode som kan brukes til å destabilisere kuleproteiner og dissosiere proteinkomplekser på en reversibel måte. Hydrostatisk trykk driver termodynamisk likevekt mot staten(e) med lavere molarvolum. Økende trykk gir derfor mulighetene til å finjustere stabiliteten til kulelige proteiner og oligomeriseringslikevekten til proteinkomplekser. Høytrykks NMR-eksperimenter tillater en detaljert karakterisering av faktorene som styrer stabiliteten til kuleformede proteiner, deres foldemekanismer og oligomeriseringsmekanismer ved å kombinere den fine stabilitetsjusteringsevnen til trykkperturbasjon og stedsoppløsningen som tilbys av løsning NMR-spektroskopi. Her presenterer vi en protokoll for å sondere den lokale foldestabiliteten til et protein via et sett med 2D 1H-15N eksperimenter registrert fra 1 bar til 2,5 kbar. Trinnene som kreves for innsamling og analyse av slike eksperimenter er illustrert med data innhentet på RRM2-domenet til hnRNPA1.
Det har lenge vært anerkjent at høyere energi, tynt befolkede konformasjonstilstander av proteiner og proteinkomplekser spiller en nøkkelrolle i mange biologiske veier1,2,3. Takket være eksperimenter basert på Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG)4, Chemical Exchange Saturation Transfer (CEST)5, og mørk-tilstand utveksling metningsoverføring (DEST)6 pulssekvenser (blant annet), løsning NMR spektroskopi har dukket opp som en metode for valg for karakterisering av forbigående konformasjonstilstander7. Sammen med disse eksperimentene kan perturbasjoner som temperatur, pH eller kjemiske denaturer innføres for å øke den relative populasjonen av høyere energikonformasjonstilstander. På samme måte kan proteinlikevekter også bli forstyrret ved å bruke høyt hydrostatisk trykk. Avhengig av størrelsen på volumendringen forbundet med de tilsvarende konformasjonsendringene, kan en økning av trykket med noen få hundre til noen få tusen barer stabilisere en høyere energitilstand eller føre til at et protein helt utfolder seg8,9,10. Protein NMR spektra viser vanligvis to typer endringer med hydrostatisk trykk: (i) kjemiske skiftendringer og (ii) toppintensitetsendringer. Kjemiske skiftendringer gjenspeiler endringer i proteinoverflatevanngrensesnittet og/eller lokal kompresjon av proteinstrukturen på rask tidsskala (i forhold til NMR-tidsskala)11. Crosspeaks som viser store ikke-lineære kjemiske skift trykkavhengighet kan indikere tilstedeværelsen av høyere energikonformasjonstilstander12,13. På den annen side peker endringer i toppintensiteten på store konformasjonsoverganger på en langsom tidsskala, for eksempel endringer i brettede/utfoldede tilstandspopulasjoner. Tilstedeværelsen av sammenleggbare mellomprodukter eller høyere energitilstander kan påvises fra store variasjoner i volumendringens størrelse ved utfoldelse målt for forskjellige rester av et gitt protein14,15,16,17. Basert på vår erfaring viser selv små proteiner som vanligvis er klassifisert som tostatsmapper ikke-ensartede respons på trykk, noe som gir nyttig informasjon om deres lokale foldestabilitet. Beskrevet her er en protokoll for oppkjøp og analyse av blant toppintensitet og 1H kjemiske skift trykkavhengighet, ved hjelp av som modellprotein det isolerte RNA-anerkjennelsesmotivet 2 (RRM2) av det heterogene kjernefysiske ribonukleoproteinet A1 (hnRNPA1).
Denne studien beskriver en protokoll implementert for å undersøke proteinstrukturelle og termodynamikkresponser på trykkperturbasjon. Høytrykkseksperimentene som er registrert her på RRM2, viser at store variasjoner i ΔVU-verdier, som indikerer ikke-fullt samarbeidsvillig utfoldelse, finnes i et relativt lite enkelt domeneprotein. Et lignende bilde kommer ut av analysen av 1H kjemiske skiftendringer under trykk. Det skal bemerkes kalbitzer og kolleger har vist at en mer dyptgående analyse av …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av midler fra Roy J. Carver Charitable Trust til Julien Roche. Vi takker J. D. Levengood og B. S. Tolbert for vennlig å gi RRM2-prøven.
Bruker Nmr Cell 2.5 Kbar | Daedalus Innovations LLC | NMRCELL-B | |
Sparky3 | University of California San Francisco, CA | N/A | |
Xtreme-60 Syringe pump | Daedalus Innovations LLC | XTREME-60 |