Hiperaktif piggyBac Transposase aracılı Germline Dönüşümü Sonbahar Ordu Kurdu, Spodoptera frugiperda
Summary
Sonbahar ordu kurdunda başarılı germline dönüşümü, Spodoptera frugiperda, hiperaktif piggyBac transposase mRNA kullanılarak elde edildi.
Abstract
Genetik kargonun transpoze edilebilir elementler kullanılarak böcek genomlarına istikrarlı bir şekilde yerleştirilmesi, fonksiyonel genomik çalışmalar ve genetik haşere yönetim stratejileri geliştirmek için güçlü bir araçtır. Böcek dönüşümünde en çok kullanılan transpoze edilebilir element piggyBacve piggyBactabanlı germline dönüşümü model böceklerde başarıyla gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu teknolojiyi tarım zararlılarını içeren model olmayan böceklerde çalıştırmak hala zordur. Bu makale, hiperaktif piggyBac transposase (hyPBase) kullanılarak küresel bir tarım zararlısının, sonbahar ordu kurdunun (FAW), Spodoptera frugiperda’nıngermline dönüşümini rapor ediyor.
Bu çalışmada hyPBase mRNA embriyo mikroenjeksiyonlarında yardımcı plazmid yerine üretilmiş ve kullanılmıştır. Bu değişiklik, transgenik FAW’ın başarılı bir şekilde üretilmesine yol açtı. Ayrıca transgenik hayvanların taranması, transgene yerleştirmenin PCR tabanlı hızlı tespiti ve entegrasyon sahasının termal asimetrik interlaced PCR (TAIL-PCR) tabanlı belirlenmesi yöntemleri de açıklanmıştır. Bu nedenle, bu makale FAW ve diğer lepidopteran böceklerde domuzbactabanlı transgenez kolaylaştıracak transgenik FAW üretmek için bir protokol sürmektedir.
Introduction
Sonbahar ordu kurdu (FAW), Spodoptera frugiperda, Amerika’nın tropikal ve subtropikal bölgelerine özgüdür. Şu anda, bu dünya çapında 100’den fazla ülkede yıkıcı bir böcek otobur1. FAW larvaları, bazı önemli temel gıda bitkileri de dahil olmak üzere 350’den fazla konak bitki ile beslenir2. FAW yetişkinlerinin güçlü göç yeteneği, Amerika’dan diğer yerlere hızla yayılmasına katkıda bulunur1,2. Sonuç olarak, bu böcek şimdi uluslararası gıda güvenliğini tehdit ediyor. Yeni teknolojilerin uygulanması FAW’da ileri çalışmaları kolaylaştırabilir ve bu zararlıyı yönetmek için yeni stratejiler sağlayabilir.
Böcek germline dönüşümü gen fonksiyonunu incelemek ve genetik kontrolde kullanılmak üzere transgenik böcekler üretmek için kullanılmıştır3,4. Böceklerde genetik dönüşümü sağlamak için kullanılan çeşitli yöntemler arasında, piggyBac element tabanlı yöntem en çok kullanılan yöntemdir5. Bununla birlikte, düşük transpozisyon oranı nedeniyle, model olmayan böceklerde transgenez yapmak hala zordur. Son zamanlarda, piggyBac transposase ‘nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi6,7. Germline dönüşümü FAW’da yakın zamanda elde edildi8Lepidopteran böceklerinde hyPBase’i kullanan ilk rapordur. Bu raporda, transgenik FAW oluşturmada hyPBase mRNA kullanımı hakkında ayrıntılı bilgi açıklanmıştır. Burada açıklanan yöntem, diğer lepidopteran böceklerinin dönüşümini sağlamak için uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transpozisyon oranının düşük olması ve transgenik bileşenleri taze embriyolara ulaştırmanın zorluğu, özellikle sipariş olan Lepidoptera’dan gelen birçok model olmayan böcekte germline dönüşümünün başarısını sınırlar. Germline dönüşüm oranını artırmak için, en yaygın kullanılan piggyBac transposase’nin (hyPBase) hiperaktif bir sürümü geliştirildi7,10. Bugüne kadar, lepidopteran böceklerde başarılı germline dö…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Rapor edilen araştırma Ulusal Bilim Vakfı I/UCRC tarafından desteklenmektedir, Eklembacaklı Yönetim Teknolojileri Merkezi, Grant No IIP-1821936 ve endüstri ortakları tarafından, Tarım ve Gıda Araştırma Girişimi Rekabetçi Hibe No. 2019-67013-29351 ve Ulusal Gıda ve Tarım Enstitüsü, ABD Tarım Bakanlığı (2019-67013-29351 ve 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
