Hyperaktiv piggyBac Transposase-medieret Germline Transformation i Efteråret Armyworm, Spodoptera frugiperda
Summary
Vellykket kimlinje transformation i efteråret armyworm, Spodoptera frugiperda, blev opnået ved hjælp af mRNA af hyperaktiv piggyBac transposase.
Abstract
Stabil indsættelse af genetisk last i insektgenomer ved hjælp af transposable elementer er et kraftfuldt værktøj til funktionelle genomiske undersøgelser og udvikling af genetiske skadedyrsbekæmpelsesstrategier. Det mest anvendte transposable element i insekttransformation er piggyBac, og piggyBac-baseretkimlinjetransformation er blevet udført med succes i modelinsekter. Det er dog stadig udfordrende at anvende denne teknologi i ikke-modelinsekter, der omfatter skadedyr i landbruget. Dette papir rapporter om kimlinje transformation af en global landbrugs skadedyr, faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, ved hjælp af hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I dette arbejde blev hyPBase mRNA produceret og brugt i stedet for hjælper plasmid i embryo mikroinjections. Denne ændring førte til en vellykket generation af transgene FAW. Desuden beskrives metoderne til screening af transgene dyr, PCR-baseret hurtig påvisning af transgeneindføring og termisk asymmetrisk interlaced PCR (TAIL-PCR)-baseret bestemmelse af integrationsstedet. Således præsenterer dette papir en protokol til fremstilling af transgene FAW, som vil lette piggyBac-baserettransgenese i FAW og andre lepidopteran insekter.
Introduction
Faldet armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, er hjemmehørende i tropiske og subtropiske regioner i Amerika. I øjeblikket er dette en ødelæggende insekt planteæder i mere end 100 lande verden over1. FAW larver foder på mere end 350 værtsplanter, herunder nogle vigtige korte fødevarer afgrøder2. FAW-voksnes stærke migrationsevne bidrager til dens nylige hurtige spredning fra Amerika til andre steder1,2. Som følge heraf truer dette insekt nu fødevaresikkerheden internationalt. Anvendelse af nye teknologier kan lette avancerede undersøgelser i FAW og give nye strategier til at styre dette skadedyr.
Transformation af insektkimlinjen er blevet brugt til at studere genfunktion og generere transgene insekter til brug i genetisk kontrol3,4. Blandt de forskellige metoder, der anvendes til at opnå genetisk transformation i insekter, er piggyBac-elementbaseret metode den mest anvendte metode5. På grund af den lave gennemførelsesrate er det dog stadig udfordrende at udføre transgenese hos ikke-modelinsekter. For nylig blev en hyperaktiv version af piggyBac transposase (hyPBase) udviklet6,7. Germline transformation blev opnået i FAW for nylig8, hvilket er den første rapport, der brugte hyPBase i lepidopteran insekter. I denne rapport beskrives detaljerede oplysninger om anvendelse af hyPBase mRNA til generering af transgen FAW. Den metode, der er beskrevet her, kunne anvendes til at opnå omdannelsen af andre lepidopteran insekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den lave gennemførelsesgrad og vanskeligheden ved at levere transgene komponenter til friske embryoner begrænser succesen af bakterielintransformation i mange ikke-modelinsekter, især dem fra orden, Lepidoptera. For at øge bakterielinjen transformation sats, en hyperaktiv version af de mest udbredte piggyBac transposase (hyPBase) blev udviklet7,10. Til dato er vellykket kimlinjetransformation i lepidopteran insekter hovedsageligt rapporteret i modell…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den rapporterede forskning er støttet af National Science Foundation I / UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 og af industripartnere, Landbrug og Fødevareforskningsinitiativ Competitive Grant No. 2019-67013-29351 og National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 og 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
