Hyperactief biggeBac Transposase-gemedieerde kiembaantransformatie in de herfst Legerworm, Spodoptera frugiperda
Summary
Succesvolle kiembaantransformatie in de herfstlegerworm, Spodoptera frugiperda, werd bereikt met behulp van mRNA van hyperactief piggyBac transposase.
Abstract
Stabiele insertie van genetische lading in insectengenomen met behulp van transponeerbare elementen is een krachtig hulpmiddel voor functionele genomische studies en het ontwikkelen van genetische plaagbestrijdingsstrategieën. Het meest gebruikte transponeerbare element in insectentransformatie is piggyBacen piggyBac-gebaseerdekiembaantransformatie is met succes uitgevoerd in modelinsecten. Het is echter nog steeds een uitdaging om deze technologie toe te passen in niet-modelinsecten die landbouwongedierte bevatten. Dit artikel rapporteert over kiembaantransformatie van een wereldwijde landbouwplaag, de herfstlegerworm (FAW), Spodoptera frugiperda, met behulp van het hyperactieve varkenBac transposase (hyPBase).
In dit werk werd het hyPBase-mRNA geproduceerd en gebruikt in plaats van helpplasmide in embryonale micro-injecties. Deze verandering leidde tot de succesvolle generatie van transgene FAW. Verder worden ook de methoden voor het screenen van transgene dieren, pcr-gebaseerde snelle detectie van transgene insertie en thermische asymmetrische interlaced PCR (TAIL-PCR) -gebaseerde bepaling van de integratieplaats beschreven. Dit artikel presenteert dus een protocol om transgene FAW te produceren, wat piggyBac-gebaseerdetransgenese in FAW en andere lepidoptera-insecten zal vergemakkelijken.
Introduction
De herfstlegerworm (FAW), Spodoptera frugiperda, is inheems in tropische en subtropische gebieden van Amerika. Momenteel is dit een verwoestende insectenherbivoor in meer dan 100 landen wereldwijd1. FAW-larven voeden zich met meer dan 350 waardplanten, waaronder enkele belangrijke basisvoedselgewassen2. Het sterke migratievermogen van FAW-volwassenen draagt bij aan de recente snelle verspreiding van Amerika naar andere plaatsen1,2. Als gevolg hiervan bedreigt dit insect nu de voedselzekerheid internationaal. Het toepassen van nieuwe technologieën kan geavanceerde studies in FAW vergemakkelijken en nieuwe strategieën bieden om deze plaag te beheersen.
Insectenkiemlijntransformatie is gebruikt om de genfunctie te bestuderen en transgene insecten te genereren voor gebruik bij genetische controle3,4. Van de verschillende methoden die worden gebruikt om genetische transformatie bij insecten te bereiken, is de op piggyBac-elementen gebaseerde methode de meest gebruikte methode5. Vanwege de lage transpositiesnelheid is het echter nog steeds een uitdaging om transgenese uit te voeren bij niet-modelinsecten. Onlangs is een hyperactieve versie van piggyBac transposase (hyPBase) ontwikkeld6,7. Kiembaantransformatie werd onlangs bereikt in FAW8, het eerste rapport dat de hyPBase gebruikte bij lepidoptera-insecten. In dit rapport wordt gedetailleerde informatie beschreven over het gebruik van hyPBase mRNA bij het genereren van transgene FAW. De hier beschreven methode kan worden toegepast om de transformatie van andere lepidoptera-insecten te bereiken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lage omzettingssnelheid en de moeilijkheid om transgene componenten in verse embryo’s af te leveren, beperken het succes van kiembaantransformatie bij veel niet-modelinsecten, vooral die van orde, Lepidoptera. Om de kiembaantransformatiesnelheid te verhogen, werd een hyperactieve versie van het meest gebruikte piggyBac transposase (hyPBase) ontwikkeld7,10. Tot op heden wordt succesvolle kiembaantransformatie in lepidopteran insecten voornamelijk gemel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het gerapporteerde onderzoek wordt ondersteund door de National Science Foundation I / UCRC, het Center for Arthropod Management Technologies, onder Grant No IIP-1821936 en door industriële partners, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 en het National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 en 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
