Hyperaktiv piggyBac Transposase-mediert Germline Transformation i Fall Armyworm, Spodoptera frugiperda
Summary
Vellykket bakterietransformasjon i fallhærormen, Spodoptera frugiperda, ble oppnådd ved hjelp av mRNA av hyperaktiv piggyBac transposase.
Abstract
Stabil innsetting av genetisk last i insektgenomer ved hjelp av transponerbare elementer er et kraftig verktøy for funksjonelle genomiske studier og utvikling av genetiske skadedyrshåndteringsstrategier. Det mest brukte transponerbare elementet i insekttransformasjon er piggyBac, og piggyBac-basertbakterietransformasjon har blitt vellykket utført i modellinsekter. Det er imidlertid fortsatt utfordrende å bruke denne teknologien i ikke-modellinsekter som inkluderer landbruksskade. Denne artikkelen rapporterer om bakterietransformasjon av et globalt landbruksskade, fallhærormen (FAW), Spodoptera frugiperda, ved hjelp av hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I dette arbeidet ble hyPBase mRNA produsert og brukt i stedet for hjelperplasmid i embryomikroinjeksjoner. Denne endringen førte til den vellykkede generasjonen av transgen FAW. Videre er metodene for screening av transgene dyr, PCR-basert rask deteksjon av transgene innsetting og termisk asymmetrisk sammenflettet PCR (TAIL-PCR)-basert bestemmelse av integrasjonsstedet, også beskrevet. Dermed presenterer dette papiret en protokoll for å produsere transgene FAW, som vil lette piggyBac-baserttransgenese i FAW og andre lepidopteran insekter.
Introduction
Fallhærormen (FAW), Spodoptera frugiperda, er innfødt til tropiske og subtropiske regioner i Amerika. For tiden er dette en ødeleggende insekt plantelevende i mer enn 100 land over hele verden1. FAW larver spiser på mer enn 350 vertsplanter, inkludert noen viktige stiftematavlinger2. Den sterke migrasjonsevnen til FAW voksne bidrar til sin nylige raske spredning fra Amerika til andre steder1,2. Som et resultat truer dette insektet nå matsikkerhet internasjonalt. Bruk av ny teknologi kan legge til rette for avanserte studier i FAW og gi nye strategier for å håndtere dette.
Insekt germline transformasjon har blitt brukt til å studere genfunksjon og generere transgene insekter for bruk i genetisk kontroll3,4. Blant de ulike metodene som brukes for å oppnå genetisk transformasjon i insekter, er piggyBac elementbasert metode den mest brukte metoden5. På grunn av den lave transposisjonen er det imidlertid fortsatt utfordrende å gjennomføre transgenese i ikke-modellinsekter. Nylig ble en hyperaktiv versjon av piggyBac transposase (hyPBase) utviklet6,7. Germline transformasjon ble oppnådd i FAW nylig8, som er den første rapporten som brukte hyPBase i lepidopteran insekter. I denne rapporten beskrives detaljert informasjon om bruk av hyPBase mRNA ved generering av transgen FAW. Metoden beskrevet her kan brukes for å oppnå transformasjon av andre lepidopteran insekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den lave graden av transposisjon og vanskeligheter med å levere transgene komponenter til friske embryoer begrenser suksessen til bakterietransformasjon i mange ikke-modellinsekter, spesielt de fra rekkefølge, Lepidoptera. For å øke bakterietransformasjonshastigheten ble en hyperaktiv versjon av den mest brukte piggyBac transposase (hyPBase) utviklet7,10. Til dags dato er vellykket bakterietransformasjon i lepidopteran insekter hovedsakelig rapporter…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen som rapporteres støttes av National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 og av industripartnere, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 og National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 og 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
