Transformação germline hiperativa da Transposase mediada pela Transposase no Verme do Exército de Outono, Spodoptera frugiperda
Summary
A transformação germinal bem sucedida no verme do exército de outono, Spodoptera frugiperda,foi alcançada usando mRNA de transposase hiperativo piggyBac.
Abstract
A inserção estável da carga genética em genomas de insetos usando elementos transposáveis é uma poderosa ferramenta para estudos genômicos funcionais e desenvolvimento de estratégias genéticas de manejo de pragas. O elemento transposável mais usado na transformação de insetos é o piggyBac, e a transformação germinal baseada em piggyBactem sido conduzida com sucesso em insetos modelo. No entanto, ainda é desafiador empregar essa tecnologia em insetos não-modelo que incluem pragas agrícolas. Este artigo relata a transformação germinal de uma praga agrícola global, a minhoca de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,usando a transposase hiperativa piggyBac (hyPBase).
Neste trabalho, o mRNA hyPBase foi produzido e utilizado no lugar de plasmídeo de ajudante em microinjeções de embriões. Essa mudança levou à geração bem sucedida de FAW transgênico. Além disso, também são descritos os métodos de triagem de animais transgênicos, a detecção rápida da inserção transgênica baseada em PCR e a determinação assimétrica do local de integração. Assim, este artigo apresenta um protocolo para produzir FAW transgênico, o que facilitará a transgênese baseada em piggyBacna FAW e outros insetos lepidopteranos.
Introduction
O verme do exército de outono (FAW), Spodoptera frugiperda,é nativo de regiões tropicais e subtropicais da América. Atualmente, este é um herbívoro de insetos devastador em mais de 100 países em todo o mundo1. As larvas faw se alimentam de mais de 350 plantas hospedeiras, incluindo algumas importantes culturas alimentaresbásicas 2. A forte capacidade migratória dos adultos da FAW contribui para sua recente rápida disseminação das Américas para outros lugares1,2. Como resultado, este inseto está ameaçando a segurança alimentar internacionalmente. A aplicação de novas tecnologias pode facilitar estudos avançados na FAW e fornecer novas estratégias para gerenciar essa praga.
A transformação da germinação de insetos tem sido usada para estudar a função genética e gerar insetos transgênicos para uso no controle genético3,4. Entre os vários métodos utilizados para alcançar a transformação genética em insetos, o método baseado em elementos piggyBac é o método mais utilizado5. No entanto, devido à baixa taxa de transposição, ainda é desafiador realizar transgênese em insetos não modelo. Recentemente, uma versão hiperativa de piggyBac transposase (hyPBase) foi desenvolvida6,7. A transformação germinal foi alcançada na FAW recentemente8, que é o primeiro relatório que utilizou o hyPBase em insetos lepidopteranos. Neste relatório, são descritas informações detalhadas sobre a contratação de mRNA hipPBase na geração de FAW transgênicos. O método aqui descrito poderia ser aplicado para alcançar a transformação de outros insetos lepidopteranos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A baixa taxa de transposição e a dificuldade de entregar componentes transgênicos em embriões frescos limitam o sucesso da transformação germinal em muitos insetos não-modelo, especialmente aqueles da ordem, Lepidoptera. Para aumentar a taxa de transformação germinal, foi desenvolvida uma versão hiperativa da transposase de piggyBac mais utilizada (hyPBase)7,10. Até o momento, a transformação germinal bem sucedida em insetos lepidopteranos ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa relatada é apoiada pela National Science Foundation I/UCRC, o Center for Arthropod Management Technologies, sob o Grant No IIP-1821936 e por parceiros da indústria, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 e o National Institute of Food and Agriculture, Departamento de Agricultura dos EUA (2019-67013-29351 e 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
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