Hyperaktiv piggyBac Transposase-medierad bakterieomvandling i höstarmén, Spodoptera frugiperda
Summary
Framgångsrika bakteriell omvandling i hösten armyworm, Spodoptera frugiperda, uppnåddes med mRNA av hyperaktiv piggyBac transposase.
Abstract
Stabil införande av genetisk last i insektsgenom med hjälp av transponerbara element är ett kraftfullt verktyg för funktionella genomiska studier och utveckling av genetiska skadedjurshanteringsstrategier. Det mest använda transponerbara elementet i insektsomvandling är piggyBac, och piggyBac-baseradbakterieomvandling har framgångsrikt utförts i modellinsekter. Det är dock fortfarande utmanande att använda denna teknik i icke-modellinsekter som inkluderar jordbruksskadedjur. Detta dokument rapporterar om bakteriell omvandling av ett globalt jordbruksskadedjur, fallarmémask (FAW), Spodoptera frugiperda, med hjälp av hyperaktiv piggyBac transposase (hyPBase).
I detta arbete producerades hyPBase mRNA och användes i stället för helperplasmid i embryomikroinjektioner. Denna förändring ledde till den framgångsrika generationen av transgena FAW. Dessutom beskrivs metoderna för screening av transgena djur, PCR-baserad snabb detektion av transgene införing och termisk asymmetrisk sammanflätad PCR (TAIL-PCR) baserad bestämning av integrationsplatsen. Således presenterar detta dokument ett protokoll för att producera transgena FAW, vilket kommer att underlätta piggyBac-baseradtransgenes i FAW och andra lepidopteran insekter.
Introduction
Hösten armyworm (FAW), Spodoptera frugiperda, är infödd till tropiska och subtropiska regioner i Amerika. För närvarande är detta en förödande insekts växtätare i mer än 100 länder över hela världen1. FAW larver matar på mer än 350 värdväxter, inklusive några viktiga basfödsgrödor2. Den starka migrationsförmågan hos FAW vuxna bidrar till dess senaste snabba spridning från Amerika till andra platser1,2. Som ett resultat hotar denna insekt nu livsmedelsförsörjningen internationellt. Tillämpning av ny teknik kan underlätta avancerade studier i FAW och ge nya strategier för att hantera detta skadedjur.
Insektsgroddstransformation har använts för att studera genfunktion och generera transgena insekter för användning i genetisk kontroll3,4. Bland de olika metoderna som används för att uppnå genetisk omvandling hos insekter är den piggyBac-elementbaserade metoden den mest använda metoden5. Men på grund av den låga transpositionshastigheten är det fortfarande utmanande att genomföra transgenes i icke-modellinsekter. Nyligen utvecklades en hyperaktiv version av piggyBac transposase (hyPBase)6,7. Bakteriell omvandling uppnåddes i FAW nyligen8, vilket är den första rapporten som använde hyPBase i lepidopteran insekter. I denna rapport beskrivs detaljerad information om att använda hyPBase mRNA för att generera transgena FAW. Metoden som beskrivs här kan tillämpas för att uppnå omvandlingen av andra lepidopteran insekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den låga graden av införlivande och svårigheten att leverera transgena komponenter till färska embryon begränsar framgången för bakteriell omvandling i många icke-modellinsekter, särskilt de från ordning, Lepidoptera. För att öka bakterieomvandlingshastigheten utvecklades en hyperaktiv version av den mest använda piggyBac-transponerasen (hyPBase)7,10. Hittills rapporteras framgångsrik bakterieomvandling i lepidopteran insekter främst i mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den rapporterade forskningen stöds av National Science Foundation I/UCRC, Center for Arthropod Management Technologies, under Grant No IIP-1821936 och av branschpartners, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 och National Institute of Food and Agriculture, US Department of Agriculture (2019-67013-29351 och 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
