Transformation germinale hyperactive médiée par la transposase chez la chenille légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda
Summary
Une transformation germinale réussie chez la légionnaire d’automne, Spodoptera frugiperda,a été obtenue en utilisant l’ARNm de la transposase hyperactive piggyBac.
Abstract
L’insertion stable de cargaisons génétiques dans les génomes d’insectes à l’aide d’éléments transposables est un outil puissant pour les études génomiques fonctionnelles et l’élaboration de stratégies de lutte génétique contre les ravageurs. L’élément transposable le plus utilisé dans la transformation des insectes est piggyBac, et la transformation germinale à base de piggyBaca été menée avec succès chez des insectes modèles. Cependant, il est toujours difficile d’utiliser cette technologie dans des insectes non modèles qui incluent des ravageurs agricoles. Cet article rend compte de la transformation germinale d’un ravageur agricole mondial, la légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,en utilisant la transposase hyperactive piggyBac (hyPBase).
Dans ce travail, l’ARNm hyPBase a été produit et utilisé à la place du plasmide auxiliaire dans les microinjections embryonnaires. Ce changement a conduit à la génération réussie de FAW transgénique. En outre, les méthodes de dépistage des animaux transgéniques, la détection rapide de l’insertion de transgènes par PCR et la détermination du site d’intégration par PCR entrelacée asymétrique thermique (TAIL-PCR) sont également décrites. Ainsi, cet article présente un protocole pour produire du FAW transgénique, qui facilitera la transgénèse à base de piggyBacchez le FAW et d’autres insectes lépidoptères.
Introduction
La chenille légionnaire d’automne (FAW), Spodoptera frugiperda,est originaire des régions tropicales et subtropicales d’Amérique. Actuellement, il s’agit d’un insecte herbivore dévastateur dans plus de 100 pays à travers le monde1. Les larves de FAW se nourrissent de plus de 350 plantes hôtes, y compris d’importantes cultures vivrières de base2. La forte capacité de migration des adultes FAW contribue à sa récente propagation rapide des Amériques à d’autres endroits1,2. En conséquence, cet insecte menace maintenant la sécurité alimentaire à l’échelle internationale. L’application de nouvelles technologies peut faciliter les études avancées sur la FAW et fournir de nouvelles stratégies pour lutter contre ce ravageur.
La transformation de la lignée germinale des insectes a été utilisée pour étudier la fonction des gènes et générer des insectes transgéniques à utiliser dans le contrôle génétique3,4. Parmi les différentes méthodes utilisées pour réaliser la transformation génétique chez les insectes, la méthode à base d’éléments piggyBac est la méthode la plus utilisée5. Cependant, en raison du faible taux de transposition, il est encore difficile de procéder à la transgénèse chez les insectes non modèles. Récemment, une version hyperactive de la transposase piggyBac (hyPBase) a été développée6,7. La transformation de la lignée germinale a été réalisée dans FAW récemment8, qui est le premier rapport qui a utilisé l’hyPBase chez les insectes lépidoptères. Dans ce rapport, des informations détaillées sur l’utilisation de l’ARNm hyPBase dans la génération de FAW transgénique sont décrites. La méthode décrite ici pourrait être appliquée pour réaliser la transformation d’autres insectes lépidoptères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le faible taux de transposition et la difficulté d’administrer des composants transgéniques dans des embryons frais limitent le succès de la transformation de la lignée germinale chez de nombreux insectes non modèles, en particulier ceux de l’ordre, les lépidoptères. Pour augmenter le taux de transformation de la lignée germinale, une version hyperactive de la transposase piggyBac la plus utilisée (hyPBase) a été développée7,10. À ce jo…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche rapportée est soutenue par la National Science Foundation I / UCRC, le Center for Arthropod Management Technologies, sous le numéro de subvention IIP-1821936 et par des partenaires de l’industrie, Agriculture and Food Research Initiative Competitive Grant No. 2019-67013-29351 et le National Institute of Food and Agriculture, DÉPARTEMENT DE L’Agriculture des États-Unis (2019-67013-29351 et 2353057000).
Materials
| 1.5" Dental Cotton Rolls | PlastCare USA | 8542025591 | REARING |
| 1 oz Souffle Cup Lids | DART | PL1N | |
| 1 oz Souffle Cups | DART | P100N | REARING |
| 48 oz Plastic Deli Containers | Genpack | AD48 | REARING |
| Add-on Filter Set (Green) | NightSea LLC | SFA-BLFS-GR | SCREENING |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF100-50-10 | INJECTION |
| Borosilicate Glass | SUTTER INSTRUMENT | BF-100-50-10 | |
| Dissecting Scope | Nikon | SMZ745T | SCREENING |
| Featherweight Forceps | BioQuip | 4750 | REARING |
| Gutter Guard | ThermWell Products | VX620 | REARING |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | INJECTION |
| Microinjector | Narishige | IM-300 | INJECTION |
| Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | INJECTION |
| Microscope Slides | VWR | 16004-22 | INJECTION |
| NightSea Full System | NightSea LLC | SFA-RB-DIM | SCREENING |
| Nitrogen Gas | AWG/Scott-Gross | NI 225 | INJECTION |
| Paper Towels | Bounty | 43217-45074 | REARING |
| Spodoptera frugiperda Artificial Diet | Southland Products, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Spodoptera frugiperda Eggs | Benzon Research, Inc | N/A [Request Species/Quantity] | REARING |
| Taq MasterMix | polymerase mixture |
References
- Gui, F., et al. Genomic and transcriptomic analysis unveils population evolution and development of pesticide resistance in fall armyworm Spodoptera frugiperda. Protein Cell. , (2020).
- Montezano, D. G., et al. Host plants of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) in the Americas. African Entomology. 26 (2), 286-300 (2018).
- Li, Z., et al. Ectopic expression of ecdysone oxidase impairs tissue degeneration in Bombyx mori. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1809), 20150513 (2015).
- Ogaugwu, C. E., Schetelig, M. F., Wimmer, E. A. Transgenic sexing system for Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) based on female-specific embryonic lethality. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 43 (1), 1-8 (2013).
- Gregory, M., Alphey, L., Morrison, N. I., Shimeld, S. M. Insect transformation with piggyBac: getting the number of injections just right. Insect Molecular Biology. 25 (3), 259-271 (2016).
- Otte, M., et al. Improving genetic transformation rates in honeybees. Scientific Reports. 8 (1), 16534 (2018).
- Eckermann, K. N., et al. Hyperactive piggyBac transposase improves transformation efficiency in diverse insect species. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 98, 16-24 (2018).
- Chen, X., Koo, J., Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Caenorhabditis elegans systemic RNA interference defective protein 1 enhances RNAi efficiency in a lepidopteran insect, the fall armyworm, in a tissue-specific manner. RNA Biology. , 1-9 (2020).
- Liu, Y. G., Chen, Y. High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences. Biotechniques. 43 (5), 649-650 (2007).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Xu, H., O’Brochta, D. A. Advanced technologies for genetically manipulating the silkworm Bombyx mori, a model Lepidopteran insect. Proceedings, Biological Sciences. 282 (1810), 20150487 (2015).
- Wu, S. C. -. Y., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the Unites States of America. 103 (41), 15008-15013 (2006).
- Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology. 18 (1), 81-84 (2000).
- Handler, A. M., Harrell, R. A. Germline transformation of Drosophila melanogaster with the piggyBac transposon vector. Insect Molecular Biology. 8 (4), 449-457 (1999).
- Dreyfus, M., Régnier, P. The poly (A) tail of mRNAs: bodyguard in eukaryotes, scavenger in bacteria. Cell. 111 (5), 611-613 (2002).
