Dieses Protokoll stellt den Aufbau und die Verwendung eines vereinfachten Ganzkörperplethysmographie-Geräts vor, um das Fortschreiten bakterieller Atemwegserkrankungen nicht-invasiv zu überwachen.
Ersatztiermodelle von Krankheiten unterliegen den 3Rs der verantwortungsvollen Forschung. Es gibt eine häufige Überprüfung von Verfeinerungen von Tiermodellen, um sicherzustellen, dass sowohl der Tierschutz als auch die wissenschaftlichen Erkenntnisse mit der Verfügbarkeit neuer Technologien voranschreiten. Dieser Artikel demonstriert die Verwendung der vereinfachten Ganzkörperplethysmographie (sWBP) zur nicht-invasiven Untersuchung der respiratorischen Insuffizienz in einem Modell der letalen respiratorischen Melioidose. sWBP hat die Empfindlichkeit, die Atmung bei Mäusen während des gesamten Krankheitsverlaufs zu erkennen, so dass die moribund-assoziierten Symptome (Bradypnoe und Hypopnoe) gemessen und möglicherweise zur Entwicklung humaner Endpunktkriterien verwendet werden können.
Einige der Vorteile von sWBP im Zusammenhang mit Atemwegserkrankungen sind, dass die Überwachung der Wirtsatmung bei der Beurteilung der Funktionsstörung des primär infizierten Gewebes, nämlich der Lunge, am nächsten kommt. Neben der biologischen Bedeutung ist der Einsatz von sWBP schnell und nicht-invasiv, wodurch Stress bei Versuchstieren minimiert wird. Diese Arbeit demonstriert den Einsatz von hauseigenen sWBP-Geräten zur Überwachung von Erkrankungen im Verlauf der Ateminsuffizienz im murinen Modell der respiratorischen Melioidose.
Respiratorische bakterielle Krankheitserreger sind oft mit einer Entzündungsreaktion in der Lunge verbunden, die zu einer Lungenpathologie führt 1,2. Im klinischen Umfeld umfasst die Diagnose einer Lungenentzündung typischerweise Kulturtechniken aus Sputum, Blutsauerstoffsättigungsanalyse und Thoraxröntgen. Diese Techniken können für Kleintierinfektionsmodelle übersetzt werden, aber nur die Sauerstoffsättigungsanalyse stellt eine schnelle Echtzeitanalyse bei Mäusen auf den Schweregrad der Erkrankung dar. Die Blutsauerstoffsättigung (SpO2) wurde zuvor als Methode zur Verfolgung des Krankheitsverlaufs in Studien zu Atemwegserkrankungen untersucht; Sterbende Mäuse haben jedoch unerwartet hohe SpO2-Werte sowohl in einem Pseudomonas aeruginosa-Modell 3, die nicht die prädiktive oder sterbende Krankheit sind, wahrscheinlich, weil Mäuse ihre physiologische Aktivität modulieren können. Zu diesem Zweck wurden bisher keine diagnostischen SpO2-Werte für bakterielle Atemwegserkrankungen bei Mäusen gefunden.
Daher untersuchte diese Arbeit die Verwendung anderer klinisch relevanter Methoden zum Nachweis der Auswirkungen von Lungenerkrankungen auf die Lungenfunktion als schnelle physiologische Messung. Die vereinfachte Ganzkörperplethysmographie (sWBP) bietet die Möglichkeit, Atemfrequenz und Tiefe als schnelle, nicht-invasive biometrische Analyse zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, wie WBP-Geräte in einem Labor zusammengebautwerden 4; Einige der in solchen Studien gezeigten Komponenten sind jedoch derzeit nicht kommerziell verfügbar. Darüber hinaus erfordert das traditionelle WBP eine komplexe Datenerfassung und Datenverarbeitung basierend auf Feuchtigkeit und Temperatur 5,6. Daher wurde beschlossen, ein vereinfachtes WBP-Gerät zu entwickeln, das täglich auf Raumtemperatur / Luftfeuchtigkeit kalibriert wird und bewertet, ob der Temperatur-/Feuchtigkeitsbeitrag des Probanden selbst einen Einfluss auf das gemessene Atemvolumen hat oder nicht. So wurde eine modifizierte sWBP-Apparatur geschaffen, die die aktuell verfügbaren Materialien beschafft. Darüber hinaus wurde untersucht, ob dieses Laborgerät Veränderungen in der Atmung im Zusammenhang mit dem Fortschreiten der Krankheit während des Modells der tödlichen respiratorischen Melioidose bei Mäusen erkennen kann.
Die für diese Arbeit konstruierte sWBP-Apparatur verwendete handelsübliche Geräte und Software, um analoge Drucksensordaten zu einer digitalen Anzeige zu verarbeiten. Der Drucksensor wurde an einem luftdichten Glasgefäß mit Schottsteckern angebracht. Der Vorteil eines Glasgefäßes ist die strukturelle Steifigkeit des Materials, die Änderungen des Innendrucks des Glases widersteht und die Messung von Volumenänderungen während der Überwachung der Atmung beeinflusst. Die Probenahmekammer wurde so konstruiert, dass sie zwei Anschlüsse auf den beiden ebenen Oberflächen des quadratischen Glases hat, einen, um über einen Luer-Anschluss zur Kalibrierung auf die Kammer zuzugreifen, und den anderen, um den Drucksensor aufzunehmen. Der gewählte Drucksensor verfügt über einen hochempfindlichen Überdruckmessumformer mit einem Bereich für kleine Druckänderungen (25 mbar Bereich).
Dieses Protokoll wird anhand eines murinen Modells der respiratorischen Melioidose demonstriert. Burkholderia pseudomallei (Bp) ist der bakterielle Erreger der Melioidose – einer Krankheit, die mit tropischen Regionen der Welt assoziiertist 7. Bp wird in der Umwelt gefunden, insbesondere in feuchten Umgebungen mit stehendem Wasser und feuchtem Boden, aus denen es typischerweise subkutane Infektionen von Schnitten / Kratzern von anfälligen Wirten verursacht. Bp ist jedoch auch beim Einatmen infektiös und stellt durch Aerosolausbreitung eine potenzielle Bedrohung für den Einsatz im Bioterrorismus dar. Während vollständig virulentes Bp die Handhabung in einem BSL-3-Labor erfordert, wurde zuvor ein akapsulärer mutierter Stamm entwickelt, der bei BSL-2 sicher gehandhabt und vom Auswahlkriterium8 ausgeschlossen werden kann. Darüber hinaus wurde ein intubationsvermitteltes intratracheales (IMIT) Infektionsmodell der respiratorischen Melioidose entwickelt, um das Fortschreiten von Atemwegserkrankungen von Bp 5,9 zu untersuchen. Wir haben dieses Infektionsmodell verwendet, um die Veränderung der Atmung zu charakterisieren, die während des Fortschreitens der Krankheit durch den sterbenden Endpunkt auftritt.
sWBP ist ein attraktiver Ansatz, um das Verständnis von Atemwegsinfektionen in Kleintiermodellen zu verbessern. Wichtig ist, dass es sich um einen nicht-invasiven Ansatz handelt, und als solcher stellt er kein signifikantes Risiko dar, Versuchstiere während einer Infektionsherausforderung übermäßig zu belasten. In der Tat ist das Verfahren zur Überwachung der Atmung der Probanden ein Schnelltest, der mehrere Minuten und minimale Handhabung des Probanden erfordert. Der wissenschaftliche Nutzen ist das hochauflösende Verständnis, wie mikrobielle Krankheitserreger die Lungenfunktion während einer Erkrankung beeinflussen. Dieser Ansatz wird der Grundlagenforschung zugute kommen, das Verständnis dafür erleichtern, wie ein Krankheitserreger Krankheiten verursacht, und einen translationalen Nutzen bieten, um zu verstehen, wie ein neuartiges Therapeutikum eine Forschung wiederherstellt, die einen Zustand der Atemwegsgesundheit betrifft.
In diesem Manuskript liegen repräsentative Ergebnisse für den Erreger B. pseudomallei vor, der eine frühe lethargische Reaktion hervorruft. Nicht alle bakteriellen Lungeninfektionen sind in Mausinfektionsmodellen auf die gleiche Weise vorhanden. Bisherige Erfahrungen mit anderen Infektionsmodellen haben gezeigt, dass sich der bakterielle Erreger Klebsiella pneumoniae als asymptomatische Infektion bis zu dem Punkt darstellt, an dem Mäuse einer Infektion erliegen, ebenfalls etwa am Tag 3 nach der Infektion11. Es wird angenommen, dass der Wirtsbedarf an inspirierter Luft (d.h. das winzige Volumen) eng mit dem Grad der Lethargie zusammenhängen kann, mit dem eine bestimmte Krankheit auftritt. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um zu untersuchen, wie verschiedene bakterielle Krankheitserreger die Lungenfunktion während Atemwegserkrankungen beeinflussen. Es versteht sich, dass verschiedene Pathogene einzigartige Ansätze haben, um die Wirtsabwehr zu umgehen, einschließlich Unterschieden in (1) der Neigung, intrazelluläre oder extrazelluläre Pathogene zu sein, (2) der Fähigkeit, eine frühe/späte hypothermische Reaktion zu verursachen, und (3) der Verwendung verschiedener Repertoires von Virulenzdeterminanten 3,12,13. Daher ist es wahrscheinlich, dass verschiedene Krankheitsstrategien zu einzigartigen Auswirkungen auf die Lungenfunktion und die Atmung während der Infektion führen.
Die in diesem Protokoll beschriebenen empfohlenen Einstellungen können geändert werden, um den besonderen Herausforderungen während des sWBP gerecht zu werden. Eines der häufigsten Probleme, die während einer sWBP-Aufnahmesitzung auftreten, ist die Bewegung des Probanden innerhalb der Probenkammer. Wie bereits erwähnt, verändert diese Bewegung die Grundlinie und kann die Genauigkeit der Atemmessungen beeinträchtigen. Ein Digitalfilter wurde verwendet, um die Shifting-Baseline zu normalisieren, was trotz kleiner Bewegungen praktikable Atemmessungen ermöglicht. Übermäßige Bewegung kann eine Baseline-Messung aus dem Bereich einer Nulleingabe verschieben. Aufnahmen werden im Bereich von 1 mV (Einstellung Kanal 1) empfohlen, wodurch die Peaks der Plethysmographie noch beobachtet werden können und gleichzeitig Datenverluste außerhalb des Bereichs vermieden werden. Bei außergewöhnlich aktiven Probanden kann es notwendig sein, den Aufnahmebereich >1 mV zu erweitern, um persistente Signale außerhalb des Bereichs zu vermeiden.
Das empfohlene Verfahren erfordert eine tägliche Kalibrierung (oder bei jeder Sitzung), um Schwankungen der Umgebungsfeuchtigkeit / Temperatur zu berücksichtigen. Traditionelle WBP verwendet komplexe Berechnungen, die die Temperatur / Luftfeuchtigkeit sowohl der Umgebung als auch des Subjektsberücksichtigen 5,6. Es wurde gezeigt, dass in der vorliegenden sWBP-Vorrichtung die Auswirkungen der Wirtstemperatur/-feuchte das gemessene Atemvolumen einer Kalibrierquelle nicht signifikant verändern. Daher unterscheidet sich dieser Ansatz in sWBP grundlegend von dem >50 Jahre alten Ansatz von Drorbaugh und Fenn. Hier setzt sWBP Druckänderungen direkt mit einem gemessenen Atemvolumen in Beziehung, ohne dass der Wirt weitere Korrekturen vornehmen muss.
Es ist wichtig, das WBP von Versuchstieren mit dem klinischen WBP zu vergleichen. Die Arten von biometrischen Daten, die von sWBP zu sammeln versucht wurden, sind Atemvolumen und -frequenz. Solche Messungen werden klinisch mit einfachen Spirometriegeräten durchgeführt, bei denen ein Patient einen Atemmonitor an den Mund hält und normal in ein Gerät zur Überwachung des Luftstroms einatmet. Eine ähnliche Spirometrie bei Versuchstieren erfordert Zurückhaltung und trägt so zu Stress und einer inhärenten Störung der Atmung bei. Daher ist die einfache Spirometrie klinisch funktionell, aber nicht für Versuchstiere. WBP dient einem wesentlichen Zweck in der Klinik, um fortgeschrittene Daten zu sammeln, einschließlich solcher Messungen wie das Restvolumen der Lunge. Solche Daten können nur im Zusammenhang mit der Fähigkeit eines Probanden enthalten sein, Anweisungen zum Atmen zu befolgen, einschließlich erzwungener Exspiration (Entleerung der Lunge durch ein tiefes Ausatmen). Man kann sich nicht darauf verlassen, dass Versuchstiere den Atemanweisungen eines Forschers folgen. Viele der fortgeschrittenen Messungen, die während der WBP klinisch gesammelt wurden, können nicht an Versuchstieren reproduziert werden. WBP bei Versuchstieren unterscheidet sich grundlegend von klinischem WBP. Animal WBP versucht, einfache Beatmungsdaten (Atemfrequenz und -volumen) auf uneingeschränkte Weise zu sammeln, um Tierstress und Atemstörungen zu vermeiden. Bisher scheint die Verwendung von WBP bei Versuchstieren die in der klinischen WBP verwendeten Techniken zu replizieren, einschließlich komplexer Berechnungen basierend auf Umgebungs- und Probandentemperatur und -feuchtigkeit, jedoch ohne die Möglichkeit, die erweiterten Daten von einem Probanden zu sammeln, das Anweisungen zur Durchführung einer erzwungenen Exspiration befolgen kann. Vor diesem Hintergrund sollte gezeigt werden, ob eine vereinfachte Version des WBP ausreichen würde, um die relevante Atemfrequenz und das Atemvolumen zu erfassen, die für Studien zu Atemwegserkrankungen relevant sind. Es wurde eine Kalibrierungssitzung durchgeführt, die jede Variation der Umgebungstemperatur und -feuchtigkeit kompensierte. Darüber hinaus wurde mit einer künstlichen Maus gezeigt, dass Temperatur und Feuchtigkeit einem gemessenen Atemvolumen keinen signifikanten Einfluss auf die genaue Messung des Atemvolumens haben. Es wurde der Schluss gezogen, dass sWBP eine ausgezeichnete Anwendung für Forschungstierstudien hat, ohne dass der Benutzer eine umständliche mathematische Behandlung von Daten anwenden muss.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studien wurden durch den COBRE-Zuschuss P20GM125504-01 Sub-Project 8246 der National Institutes of Health unterstützt.
1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |