活性 秀丽隐杆线 虫核提取物的分离及重建用于 体外 转录
Summary
在这里，我们描述了从幼虫4 C. elegans 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的详细方案。
Abstract
秀丽隐杆线虫 自1963年推出以来，一直是生物学研究的重要模型系统。然而， 秀丽隐杆线虫 尚未充分利用其核提取物（如 体外 转录和DNA复制）进行生物反应的生化研究。在生化研究中使用 秀丽隐杆线虫 的一个重大障碍是破坏线虫厚厚的外角质层，而不会牺牲核提取物的活性。虽然有几种方法用于破坏角质层，例如Dounce均质化或超声处理，但它们通常会导致蛋白质不稳定。没有建立从幼虫或成年 秀丽隐杆线虫 中分离活性核蛋白用于 体外 反应的方案。在这里，该协议详细描述了使用Balch均质机对幼虫4 C.秀丽隐杆线虫的 均质化。Balch均质机使用压力缓慢地迫使动物通过狭窄的间隙，在此过程中破坏角质层。Balch 均质机的统一设计和精密加工允许在实验之间对动物进行一致的研磨。分馏从Balch均质机获得的匀浆产生功能活性核提取物，可用于 体外 方法测定 秀丽隐杆线虫的转录活性。
Introduction
小型，自由生活的线虫 秀丽隐杆线虫 是一种简单而强大的模式生物，用于解决广泛的生物学问题。自1963年引入以来，线虫对于回答神经生物学，新陈代谢，衰老，发育，免疫和遗传学方面的问题非常宝贵1。该动物的许多特征使其成为理想的模式生物，包括较短的生成时间，RNA干扰的有效性，透明的身体以及其细胞谱系和神经系统的完整图谱。
虽然线虫对科学的贡献是巨大的，但它们在阐明真核转录系统方面没有得到充分利用，我们对这些机制的大部分理解来自使用酵母，果蝇和哺乳动物细胞培养物的核提取物的研究2。阻止研究人员提取功能性核提取物的最大障碍是线虫坚韧的外角质层。这种外骨骼由交联的胶原蛋白、角质层、糖蛋白和脂质组成，使秀丽隐杆线虫从幼虫期到成年期都耐通过化学或机械力提取蛋白质3。使用秀丽隐杆线虫核提取物的体外转录系统曾经开发出来，但由于系统范围有限，未被广泛采用，使用Dounce均质机制备提取物可能导致蛋白质不稳定4，5。
与先前利用Dounce均质机破坏 秀丽隐杆线虫 的核提取物分离协议不同，该协议使用Balch均质机。Balch均质机由两个主要部件组成：一个碳化钨球和一个不锈钢块，其通道从一端钻到另一端。Balch均质机装有碳化钨球，并在两侧盖上盖子以密封研磨室。注射器可以装载在通往研磨室的两个垂直端口上。当材料通过研磨室从一个注射器传递到另一个注射器时，来自注射器的压力迫使材料通过球和腔室壁之间的狭窄间隙。这种缓慢而恒定的压力会破坏材料，直到它达到能够轻松穿过狭窄间隙的一致尺寸。通过恒定而温和的压力迫使 秀丽隐杆线虫 穿过狭窄的间隙，使动物打开，将它们的内容释放到周围的缓冲区中。切换球的大小进一步收紧间隙，破坏新释放的细胞并将细胞核释放到缓冲液中。多次离心将细胞核与其余的细胞碎片分开，从而可以收集干净的核提取物。Balch均质机优于Dounce均质机，原因如下：该系统可以处理大量动物，从而可以在一次尝试中提取大量活性蛋白;滚珠和钢块的精确加工允许在多个样品之间进行一致的磨削;重型钢块充当散热器，均匀地将热量从研磨室中吸走，防止变性。
分离后，核提取物转录活性必须在用于任何生化实验之前进行验证。传统上，使用放射性标记的核苷酸来测量转录活性，以跟踪和可视化新合成的RNA。然而，放射性标签可能很繁琐，因为它在使用和处置过程中需要采取预防措施6。技术进步使今天的研究人员能够使用危害性更小或麻烦得多的方法，使用定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）7等技术来测量即使是很小的RNA量。在这里，该协议描述了一种从幼虫4期（L4） 秀丽隐杆线虫 中分离活性核提取物并在 体外 系统中可视化转录活性的方法。
Protocol
Representative Results
Discussion
秀丽隐杆线虫 是一种研究真核转录系统的有吸引力的模式生物，因为它的维护成本低，易于遗传操作。这里描述了从L4 C. elegans 中一致分离功能活性核提取物的方案。虽然该协议侧重于可视化转录活性，但转录后产生的cDNA可以使用RT-qPCR进行定量，以获得更精确的转录活性测量8。这种从 秀丽隐杆线虫 中分离核蛋白的方法可以帮助扩大真核转录机制的研究。?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了NIH MIRA赠款（R35GM124678给J. S.）的支持。
Materials
| Consumables and reagents | |||
| 0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 mL Individual PCR tubes | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 mL sterile microtubes | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% absolute molecular grade ethanol | Fisher Scientific | BP2818 | |
| 100% ethanol, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| 10 mL serological pipet | VWR international | 89130-898 | |
| 150 mm petri plates | Tritech Research | T3325 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Genesee Scientific | 28-103 | |
| 20 mL plastic syringes | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 mL Norm-Ject syringes | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 mL serological pipet | VWR international | 89130-902 | |
| 5 mL serological pipet | VWR international | 89130-896 | |
| Agar, Criterion | VWR International | C7432 | |
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-6 | |
| Alcohol proof marker | VWR International | 52877-310 | |
| Bacto peptone | VWR International | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| Calcium dichloride | Millipore Sigma | C4901 | |
| Cholesterol | Millipore Sigma | C8667 | |
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’ | |||
| Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’ | |||
| Deionized water | |||
| Dithiothreitol | Invitrogen | 15508-013 | |
| DNA gel stain, SYBR safe | Invitrogen | S33102 | |
| DNA ladder mix, O’gene ruler | Fisher Scientific | SM1173 | |
| DNA Loading Dye, 6x TriTrack | Fisher Scientific | FERR1161 | |
| DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | DB0715K | |
| Dry ice | |||
| Escherichia coli OP50 strain | CGC | OP50 | |
| Glacial acetic acid | Fisher Scientific | A38 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G6279 | |
| HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| Hydrochloric acid 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| Hypochlorite bleach | Clorox | ||
| LB Broth | Millipore Sigma | L3022 | |
| Magnesium dichloride | Millipore Sigma | M8266 | |
| Magnesium Sulfate | Millipore Sigma | M7506 | |
| Medium weigh dishes | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| microscope slides, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| molecular grade water, Hypure | Hyclone Laboratories | SH30538 | |
| Nystatin | Millipore Sigma | N1638 | |
| PCR system, FailSafe with premix A | Lucigen | FS99100 | |
| Potassium chloride | Millipore Sigma | P39111 | |
| Potassium phosphate dibasic | Millipore Sigma | P3786 | |
| Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | |
| Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| protein assay kit, Qubit | ThermoFisher Scientific | Q33211 | |
| reverse transcription kit, Sensiscript | Qiagen | 205211 | |
| RNA extraction kit RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| RNase Inhibitor | Applied Biosystems | N8080119 | |
| Sodium Chloride | VWR International | BDH9286-12KG | |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | 1-09137 | |
| Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane | VWR international | 28145-501 | |
| Sucrose | VWR International | 200-334-9 | |
| transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’ | |||
| transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’ | |||
| Tris-Base | Fisher Scientific | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| Equipment | |||
| -20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 °C incubator | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 °C incubator | Forma Scientific | ||
| 4 °C refrigerator | ThermoFisher Scientific | ||
| -80 °C freezer | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| Centrifuge, Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Centrifuge, VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| Dissection microscope, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| Fluorometer, Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| Gel imaging system, iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| Gel system | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| Microcentrifuges, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| Rocking platform | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Génétique. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-16 (2006).
- Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-15 (2007).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Cloning and properties of the Caenorhabditis elegans TATA-box-binding protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (20), 9673-9677 (1993).
- Lichtsteiner, S., Tjian, R. Synergistic activation of transcription by UNC-86 and MEC-3 in Caenorhabditis elegans embryo extracts. EMBO Journal. 14 (16), 3937-3945 (1995).
- Shan, G., et al. Isotope-labeled immunoassays without radiation waste. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (6), 2445-2449 (2000).
- Voss, C., et al. A novel, non-radioactive eukaryotic in vitro transcription assay for sensitive quantification of RNA polymerase II activity. BMC Molecular Biology. 15, 7 (2014).
- Wibisono, P., Liu, Y., Sun, J. A novel in vitro Caenorhabditis elegans transcription system. BMC Molecular and Cell Biology. 21 (1), 87 (2020).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , 1-11 (2006).
- Zbacnik, T. J., et al. Role of buffers in protein formulations. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 713-733 (2017).
