Isolatie van actief caenorhabditis elegans nucleair extract en reconstitutie voor in vitro transcriptie

Summary

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het isoleren van actief nucleair extract uit larvale stadium 4 C. elegans en het visualiseren van transcriptieactiviteit in een in vitro systeem.

Abstract

Caenorhabditis elegans is sinds de introductie in 1963 een belangrijk modelsysteem voor biologisch onderzoek. C. elegans is echter niet volledig gebruikt in de biochemische studie van biologische reacties met behulp van zijn nucleaire extracten zoals in vitro transcriptie en DNA-replicatie. Een belangrijke hindernis voor het gebruik van C. elegans in biochemische studies is het verstoren van de dikke buitenste cuticula van de nematode zonder de activiteit van het nucleaire extract op te offeren. Hoewel verschillende methoden worden gebruikt om de nagelriem te breken, zoals Dounce-homogenisatie of ultrasoonapparaat, leiden ze vaak tot eiwitinstabiliteit. Er zijn geen vastgestelde protocollen voor het isoleren van actieve nucleaire eiwitten uit larven of volwassen C. elegans voor in vitro reacties. Hier beschrijft het protocol in detail de homogenisatie van larvale stadium 4 C. elegans met behulp van een Balch-homogenisator. De Balch-homogenisator gebruikt druk om de dieren langzaam door een smalle opening te dwingen die de cuticula breekt tijdens het proces. Het uniforme ontwerp en de nauwkeurige bewerking van de Balch-homogenisator maken een consistente slijping van dieren tussen experimenten mogelijk. Fractionering van het homogenaat verkregen uit de Balch-homogenisator levert functioneel actief nucleair extract op dat kan worden gebruikt in een in vitro methode voor het testen van de transcriptieactiviteit van C. elegans.

Introduction

De kleine, vrijlevende nematode Caenorhabditis elegans is een eenvoudig maar krachtig modelorganisme voor het aanpakken van een breed scala aan biologische vragen. Sinds de introductie in 1963 zijn de nematoden van onschatbare waarde geweest voor het beantwoorden van vragen in neurobiologie, metabolisme, veroudering, ontwikkeling, immuniteit en ^genetica1. Enkele van de vele kenmerken van het dier die het een ideaal modelorganisme maken, zijn korte generatietijd, de effectiviteit van RNA-interferentie, transparant lichaam en de voltooide kaarten van zowel de cellulaire afstamming als het zenuwstelsel.

Hoewel de bijdragen van de nematode aan de wetenschap enorm zijn, zijn ze onderbenut om het eukaryote transcriptiesysteem op te helderen, waarbij het grootste deel van ons begrip over deze mechanismen afkomstig is van studies met nucleair extract uit gist, fruitvlieg en zoogdiercelcultuur2. De grootste hindernis die onderzoekers ervan weerhoudt om functioneel nucleair extract te extraheren, is de taaie buitenste cuticula van de nematode. Dit exoskelet bestaat uit verknoopte collageen, cuticlinen, glycoproteïnen en lipiden, waardoor C. elegans van larvaal stadium tot volwassenheid resistent zijn tegen eiwitextractie via chemische of mechanische ^krachten3. Een in vitro transcriptiesysteem met C. elegans nucleair extract werd ooit ontwikkeld, maar niet op grote schaal toegepast vanwege de beperkte reikwijdte van het systeem, en het gebruik van Dounce-homogenisator voor het bereiden van het extract zou kunnen leiden tot ^{eiwitinstabiliteit4,5}.

In tegenstelling tot het vorige protocol voor nucleaire extractisolatie, waarbij een Dounce-homogenisator werd gebruikt om C. elegans te breken, gebruikt dit protocol een Balch-homogenisator. De Balch homogenisator bestaat uit twee hoofdcomponenten: een wolfraamcarbide kogel en een roestvrijstalen blok met een kanaal dat van het ene uiteinde naar het andere wordt geboord. De Balch-homogenisator wordt geladen met de wolfraamcarbidekogel en aan weerszijden afgedekt om de maalkamer af te dichten. Spuiten kunnen worden geladen op de twee verticale poorten die naar de slijpkamer leiden. Terwijl het materiaal door de slijpkamer van de ene spuit naar de andere wordt geleid, dwingt de druk van de spuiten het materiaal door een smalle opening tussen de bal en de wand van de kamer. Deze langzame en constante druk breekt het materiaal totdat het een consistente grootte bereikt die gemakkelijk door de smalle opening kan gaan. Door C. elegans via een constante maar zachte druk door de smalle opening te dwingen, breken de dieren open, waardoor hun inhoud in de omringende buffer vrijkomt. Het wisselen van kogelgroottes maakt de opening verder strakker, waardoor de nieuw vrijgegeven cellen worden gebroken en de kernen in de buffer worden bevrijd. Meerdere gevallen van centrifugatie scheiden de kernen van de rest van het celpuin, waardoor een schoon nucleair extract kan worden verzameld. De Balch-homogenisator heeft om verschillende redenen de voorkeur boven de Dounce-homogenisator: het systeem kan een groot aantal dieren aan, waardoor het mogelijk is om in één keer een grote hoeveelheid actieve eiwitten te extraheren; de nauwkeurige bewerking van de kogels en het stalen blok maakt consistent slijpen tussen meerdere monsters mogelijk; het zware stalen blok fungeert als een koellichaam en trekt gelijkmatig warmte weg van de slijpkamer, waardoor denaturering wordt voorkomen.

Na isolatie moet de transcriptionele activiteit van het nucleaire extract worden geverifieerd voordat het in biochemische experimenten wordt gebruikt. Traditioneel werd transcriptieactiviteit gemeten met behulp van radioactief gelabelde nucleotiden om het nieuw gesynthetiseerde RNA te volgen en te visualiseren. Radioactieve etikettering kan echter belastend zijn omdat het voorzorgsmaatregelen vereist tijdens gebruik en ^{verwijdering6}. Technologische vooruitgang stelt onderzoekers tegenwoordig in staat om veel minder schadelijke of lastige methoden te gebruiken om zelfs kleine RNA-hoeveelheden te meten met behulp van technieken zoals kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)⁷. Hier beschrijft het protocol een methode om actief nucleair extract te isoleren uit larvale stadium 4 (L4) C. elegans en transcriptieactiviteit in een in vitro systeem te visualiseren.

Protocol

1. Mediavoorbereidingen Bereid steriele lysogeniebouillon (LB) agarplaten en vloeibare media volgens de instructies van de fabrikant. Streak Escherichia coli (E. coli) stam OP50 op een LB agarplaat. Incubeer de bacteriestreak bij 37 °C ‘s nachts. Bewaar de E. coli OP50 streepplaat bij 4 °C na incubatie. De E. coli OP50 plaat kan veilig worden bewaard bij 4 °C gedurende 2 weken indien verpakt in parafilm om vochtverlies te voorkomen. Bereid 2 L…

Representative Results

Het volgen van de geschetste stappen zou functioneel nucleair extract moeten opleveren (figuur 1), afwijking in de maal- of wasstappen kan leiden tot slechte activiteit of lage opbrengsten. Als functioneel C. elegans nucleair extract wordt verkregen, zal het het gebied stroomafwaarts van de CMV-promotor op het DNA-sjabloon transcriberen wanneer het wordt toegevoegd aan de eerder beschreven in vitro test. Het resulterende RNA-transcript kan …

Discussion

C. elegans is een aantrekkelijk modelorganisme om het eukaryote transcriptiesysteem te bestuderen vanwege het goedkope onderhoud en het gemak van genetische manipulatie. Hier wordt een protocol voor consistente isolatie van functioneel actief nucleair extract van L4 C. elegans beschreven. Hoewel dit protocol gericht was op het visualiseren van transcriptieactiviteit, kan het cDNA dat post-transcriptioneel wordt geproduceerd, worden gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR om een nauwkeurigere meting van d…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010