Isolement de l’extrait nucléaire actif de Caenorhabditis elegans et reconstitution pour la transcription in vitro

Summary

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour isoler l’extrait nucléaire actif de C. elegans au stade larvaire 4 et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans est un système modèle important pour la recherche biologique depuis son introduction en 1963. Cependant, C. elegans n’a pas été pleinement utilisé dans l’étude biochimique des réactions biologiques utilisant ses extraits nucléaires tels que la transcription in vitro et la réplication de l’ADN. Un obstacle important à l’utilisation de C. elegans dans les études biochimiques est de perturber l’épaisse cuticule externe du nématode sans sacrifier l’activité de l’extrait nucléaire. Bien que plusieurs méthodes soient utilisées pour casser la cuticule, telles que l’homogénéisation ou la sonication de Dounce, elles conduisent souvent à une instabilité des protéines. Il n’existe pas de protocole établi pour isoler les protéines nucléaires actives de la larve ou de C. elegans adulte pour les réactions in vitro . Ici, le protocole décrit en détail l’homogénéisation de C. elegans larvaire de stade 4 à l’aide d’un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch utilise la pression pour forcer lentement les animaux à traverser un espace étroit brisant la cuticule dans le processus. La conception uniforme et l’usinage précis de l’homogénéisateur Balch permettent un meulage cohérent des animaux entre les expériences. Le fractionnement de l’homogénat obtenu à partir de l’homogénéisateur Balch donne un extrait nucléaire fonctionnellement actif qui peut être utilisé dans une méthode in vitro pour tester l’activité de transcription de C. elegans.

Introduction

Le petit nématode libre Caenorhabditis elegans est un organisme modèle simple mais puissant pour répondre à un large éventail de questions biologiques. Depuis son introduction en 1963, les nématodes ont été inestimables pour répondre aux questions de neurobiologie, de métabolisme, de vieillissement, de développement, d’immunité et de ^génétique1. Certaines des nombreuses caractéristiques de l’animal qui en font un organisme modèle idéal comprennent le temps de génération court, l’efficacité de l’interférence ARN, le corps transparent et les cartes complètes de sa lignée cellulaire et de son système nerveux.

Bien que les contributions du nématode à la science soient vastes, elles ont été sous-utilisées pour élucider le système de transcription eucaryote, la plupart de notre compréhension de ces mécanismes provenant d’études utilisant l’extrait nucléaire de levure, de mouche des fruits et de culture cellulaire de ^mammifères2. Le plus grand obstacle qui dissuade les chercheurs d’extraire de l’extrait nucléaire fonctionnel est la cuticule externe dure du nématode. Cet exosquelette comprend des collagènes réticulés, des cuticlines, des glycoprotéines et des lipides, ce qui rend C. elegans du stade larvaire à l’âge adulte résistant à l’extraction des protéines par des forces chimiques ou ^mécaniques3. Un système de transcription in vitro utilisant l’extrait nucléaire de C. elegans a déjà été développé mais n’a pas été largement adopté en raison de la portée limitée du système, et l’utilisation de l’homogénéisateur Dounce pour la préparation de l’extrait pourrait entraîner une instabilité des protéines4,5.

Contrairement au protocole précédent pour l’isolation des extraits nucléaires qui utilisait un homogénéisateur Dounce pour casser C. elegans, ce protocole utilise un homogénéisateur Balch. L’homogénéisateur Balch se compose de deux composants principaux: une bille en carbure de tungstène et un bloc en acier inoxydable avec un canal percé d’une extrémité à l’autre. L’homogénéisateur Balch est chargé avec la bille de carbure de tungstène et bouché de chaque côté pour sceller la chambre de broyage. Les seringues peuvent être chargées sur les deux orifices verticaux menant à la chambre de broyage. Lorsque le matériau est passé d’une seringue à l’autre à travers la chambre de broyage, la pression des seringues force le matériau à travers un espace étroit entre la bille et la paroi de la chambre. Cette pression lente et constante brise le matériau jusqu’à ce qu’il atteigne une taille constante capable de traverser facilement l’espace étroit. Forcer C. elegans à traverser l’étroit espace via une pression constante mais douce brise les animaux, libérant leur contenu dans le tampon environnant. Changer la taille des billes resserre encore l’écart, brisant les cellules nouvellement libérées et libérant les noyaux dans le tampon. De multiples cas de centrifugation séparent les noyaux du reste des débris cellulaires, ce qui permet la collecte d’un extrait nucléaire propre. L’homogénéisateur Balch est préféré à l’homogénéisateur Dounce pour plusieurs raisons : le système peut traiter un grand nombre d’animaux, ce qui permet d’extraire une grande quantité de protéines actives en une seule tentative ; l’usinage précis des billes et du bloc d’acier permet un meulage cohérent entre plusieurs échantillons; le bloc d’acier lourd agit comme un dissipateur de chaleur, éloignant uniformément la chaleur de la chambre de broyage, empêchant ainsi la dénaturation.

Après isolement, l’activité transcriptionnelle de l’extrait nucléaire doit être vérifiée avant d’être utilisée dans des expériences biochimiques. Traditionnellement, l’activité de transcription était mesurée à l’aide de nucléotides radiomarqués pour suivre et visualiser l’ARN nouvellement synthétisé. Cependant, l’étiquetage radioactif peut être fastidieux car il nécessite des précautions lors de l’utilisation et de l’élimination6. Les progrès technologiques permettent aux chercheurs d’aujourd’hui d’utiliser des méthodes beaucoup moins nocives ou gênantes pour mesurer même de petites quantités d’ARN à l’aide de techniques telles que la PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR)⁷. Ici, le protocole décrit une méthode pour isoler l’extrait nucléaire actif du stade larvaire 4 (L4) C. elegans et visualiser l’activité de transcription dans un système in vitro.

Protocol

1. Préparations médiatiques Préparez des plaques de gélose stériles en lysogénie (LB) et des milieux liquides en suivant les instructions du fabricant. Streak Escherichia coli (E. coli) souche OP50 sur une plaque de gélose LB. Incuber les bactéries à 37 °C pendant la nuit. Conserver la plaque de stries e. coli OP50 à 4 °C après l’incubation. La plaque E. coli OP50 peut être conservée en toute sécurité à 4 °C pendant 2 semaines si elle …

Representative Results

En suivant les étapes décrites devrait donner un extrait nucléaire fonctionnel (Figure 1), un écart dans les étapes de broyage ou de lavage peut entraîner une mauvaise activité ou de faibles rendements. Si l’extrait nucléaire fonctionnel de C. elegans est obtenu, il transcrira la région en aval du promoteur du CMV sur le gabarit d’ADN lorsqu’il sera ajouté au test in vitro décrit précédemment. Le transcrit d’ARN résult…

Discussion

C. elegans est un organisme modèle attrayant pour étudier le système de transcription eucaryote en raison de son faible coût d’entretien et de la facilité de manipulation génétique. Ici, un protocole pour l’isolement cohérent de l’extrait nucléaire fonctionnellement actif de L4 C. elegans est décrit. Bien que ce protocole se soit concentré sur la visualisation de l’activité de transcription, l’ADNc produit post-transcriptionnellement peut être quantifié à l’aide de la RT-qPCR …

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010