Isolamento da Caenorhabditis Ativa elegans Extrato Nuclear e Reconstituição para Transcrição In Vitro

Summary

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para isolar o extrato nuclear ativo do estágio 4 C. elegans larval e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro .

Abstract

Caenorhabditis elegans tem sido um importante sistema modelo de pesquisa biológica desde que foi introduzido em 1963. No entanto, C. elegans não foi totalmente utilizado no estudo bioquímico de reações biológicas usando seus extratos nucleares, como transcrição in vitro e replicação de DNA. Um obstáculo significativo para o uso de C. elegans em estudos bioquímicos é interromper a grossa cutícula externa do nematoide sem sacrificar a atividade do extrato nuclear. Embora vários métodos sejam usados para quebrar a cutícula, como homogeneização de Dounce ou sonicação, eles muitas vezes levam à instabilidade proteica. Não há protocolos estabelecidos para isolar proteínas nucleares ativas de larvas ou adultos C. elegans para reações in vitro . Aqui, o protocolo descreve detalhadamente a homogeneização do estágio larval 4 C. elegans utilizando um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch usa pressão para forçar lentamente os animais através de uma estreita abertura quebrando a cutícula no processo. O design uniforme e a usinagem precisa do homogeneizador Balch permitem uma moagem consistente de animais entre experimentos. Fracionar o homogeneizador obtido a partir do homogeneizador Balch produz extrato nuclear funcionalmente ativo que pode ser usado em um método in vitro para avaliar a atividade de transcrição de C. elegans.

Introduction

O pequeno nematode caenorhabditis elegans é um organismo modelo simples, mas poderoso, para abordar uma ampla gama de questões biológicas. Desde sua introdução em 1963, os nematoides têm sido inestimáveis para responder perguntas em neurobiologia, metabolismo, envelhecimento, desenvolvimento, imunidade e ^genética1. Algumas das muitas características do animal que o tornam um organismo modelo ideal incluem o curto tempo de geração, a eficácia da interferência do RNA, o corpo transparente e os mapas completos de sua linhagem celular e sistema nervoso.

Embora as contribuições do nematode para a ciência sejam vastas, elas têm sido subutilizados para elucidar o sistema de transcrição eucariótica, com a maioria de nosso entendimento sobre esses mecanismos provenientes de estudos que usam extrato nuclear de levedura, mosca-das-frutas e cultura celular de ^mamíferos2. O maior obstáculo que dissuade os pesquisadores de extrair extrato nuclear funcional é a dura cutícula externa do nematode. Este exoesqueleto compreende collagens transversais, cuticlins, glicoproteínas e lipídios, tornando C. elegans do estágio larval à idade adulta resistente à extração de proteínas através de forças químicas ou ^mecânicas3. Um sistema de transcrição in vitro usando extrato nuclear C. elegans já foi desenvolvido, mas não amplamente adotado devido ao escopo limitado do sistema, e o uso de homogeneizador Dounce para a preparação do extrato poderia levar à instabilidade proteica4,5.

Ao contrário do protocolo anterior para isolamento de extrato nuclear que utilizava um homogeneizador do Dounce para quebrar C. elegans, este protocolo usa um homogeneizador Balch. O homogeneizador Balch consiste em dois componentes principais: uma bola de carboneto de tungstênio e um bloco de aço inoxidável com um canal entediado de uma extremidade para outra. O homogeneizador Balch é carregado com a bola de carboneto de tungstênio e tampado em ambos os lados para selar a câmara de moagem. As seringas podem ser carregadas nas duas portas verticais que levam à câmara de moagem. À medida que o material é passado de uma seringa para a outra através da câmara de moagem, a pressão das seringas força o material através de uma estreita distância entre a bola e a parede da câmara. Esta pressão lenta e constante quebra o material até atingir um tamanho consistente que é capaz de passar pela estreita lacuna facilmente. Forçando C. elegans através da estreita lacuna através de uma pressão constante, mas suave, quebra os animais abertos, liberando seu conteúdo no buffer circundante. A troca de tamanhos de esfera aperta ainda mais a lacuna, quebrando as células recém-liberadas e libera os núcleos para o buffer. Vários casos de centrifugação separam os núcleos do resto dos detritos celulares, permitindo a coleta de um extrato nuclear limpo. O homogeneizador Balch é preferido em vez do homogeneizador do Dounce por várias razões: o sistema pode lidar com um grande número de animais, possibilitando extrair uma alta quantidade de proteínas ativas em uma única tentativa; a usinagem precisa das bolas e do bloco de aço permite uma moagem consistente entre múltiplas amostras; o bloco de aço pesado age como um dissipador de calor, afastando uniformemente o calor da câmara de moagem, impedindo a desnaturação.

Após o isolamento, a atividade transcricional do extrato nuclear deve ser verificada antes de ser usada em qualquer experimento bioquímico. Tradicionalmente, a atividade de transcrição era medida usando nucleotídeos radiolabelados para rastrear e visualizar o RNA recém-sintetizado. No entanto, a rotulagem radioativa pode ser pesada, pois requer precaução durante o uso e ^descarte6. Os avanços tecnológicos permitem que os pesquisadores de hoje usem métodos muito menos prejudiciais ou problemáticos para medir até mesmo pequenas quantidades de RNA usando técnicas como PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR)⁷. Aqui, o protocolo descreve um método para isolar o extrato nuclear ativo do estágio larval 4 (L4) C. elegans e visualizar a atividade de transcrição em um sistema in vitro.

Protocol

1. Preparações de mídia Prepare placas de ágar estéril (LB) e mídia líquida seguindo as instruções do fabricante. Streak Escherichia coli (E. coli) cepa OP50 em uma placa de ágar LB. Incubar a raia das bactérias a 37 °C durante a noite. Armazene a placa de raia E. coli OP50 a 4 °C após a incubação. A placa E. coli OP50 pode ser armazenada com segurança a 4 °C por 2 semanas se embrulhada em parafilme para evitar a perda de umidade. <…

Representative Results

Seguindo as etapas descritas deve produzir extrato nuclear funcional (Figura 1), o desvio nas etapas de moagem ou lavagem pode levar a má atividade ou baixos rendimentos. Se o extrato nuclear C. elegans funcional for obtido, ele transcreverá a região a jusante do promotor do CMV no modelo de DNA quando adicionado ao ensaio in vitro descrito anteriormente. A transcrição resultante do RNA pode ser purificada a partir das proteínas nucle…

Discussion

C. elegans é um organismo modelo atraente para estudar o sistema de transcrição eucariótica devido à sua manutenção de baixo custo e à facilidade de manipulação genética. Aqui é descrito um protocolo para o isolamento consistente do extrato nuclear funcionalmente ativo de L4 C. elegans . Embora este protocolo tenha se concentrado em visualizar a atividade de transcrição, o cDNA produzido após a transcrição pode ser quantificado usando o RT-qPCR para obter uma medição mais precisa da a…

Materials

Consumables and reagents
0.2 mL 8-Strip Tubes & Flat Strip Caps, Clear	Genesee Scientific	24-706
0.2 mL Individual PCR tubes	Genesee Scientific	24-153G
1.7 mL sterile microtubes	Genesee Scientific	24-282S
100% absolute molecular grade ethanol	Fisher Scientific	BP2818
100% ethanol, Koptec	Decon Labs	V1001
10 mL serological pipet	VWR international	89130-898
150 mm petri plates	Tritech Research	T3325
15 mL conical centrifuge tubes	Genesee Scientific	28-103
20 mL plastic syringes	Fisher Scientific	14955460
2 mL Norm-Ject syringes	Henke-Sass Wolf GmbH	4020
500 mL vacuum filter cup 0.22 µm PES, Stericup Millipore Express Plus	Millipore Sigma	SCGPU10RE
50 mL conical centrifuge tubes	ThermoFisher Scientific	339652
50 mL serological pipet	VWR international	89130-902
5 mL serological pipet	VWR international	89130-896
Agar, Criterion	VWR International	C7432
Agarose	Denville Scientific	CA3510-6
Alcohol proof marker	VWR International	52877-310
Bacto peptone	VWR International	90000-264
Caenorhabditis elegans	CGC	N2
Calcium dichloride	Millipore Sigma	C4901
Cholesterol	Millipore Sigma	C8667
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3’
Control DNA temple cloning primers, Forward 5’- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3’
Deionized water
Dithiothreitol	Invitrogen	15508-013
DNA gel stain, SYBR safe	Invitrogen	S33102
DNA ladder mix, O’gene ruler	Fisher Scientific	SM1173
DNA Loading Dye, 6x TriTrack	Fisher Scientific	FERR1161
DNase, Baseline-ZERO	Lucigen	DB0715K
Dry ice
Escherichia coli OP50 strain	CGC	OP50
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A38
Glycerol	Millipore Sigma	G6279
HeLa nuclear extract in vitro transcription system, HeLaScribe	Promega	E3110
Hepes Solution, 1 M Gibco	Millipore Sigma	15630080
Hydrochloric acid 37%	Millipore Sigma	P0662
Hypochlorite bleach	Clorox
LB Broth	Millipore Sigma	L3022
Magnesium dichloride	Millipore Sigma	M8266
Magnesium Sulfate	Millipore Sigma	M7506
Medium weigh dishes	Fisher Scientific	02-202-101
microscope slides, Vista vision	VWR International	16004-368
molecular grade water, Hypure	Hyclone Laboratories	SH30538
Nystatin	Millipore Sigma	N1638
PCR system, FailSafe with premix A	Lucigen	FS99100
Potassium chloride	Millipore Sigma	P39111
Potassium phosphate dibasic	Millipore Sigma	P3786
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662
Protease inhibitor, Halt single use cocktail 100x	ThermoFisher Scientific	78430
protein assay kit, Qubit	ThermoFisher Scientific	Q33211
reverse transcription kit, Sensiscript	Qiagen	205211
RNA extraction kit RNeasy micro kit	Qiagen	74004
RNase Inhibitor	Applied Biosystems	N8080119
Sodium Chloride	VWR International	BDH9286-12KG
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	1-09137
Sterile syringe filter with 0.2 µm Polyethersulfone membrane	VWR international	28145-501
Sucrose	VWR International	200-334-9
transcription primers, Forward 5’- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3’
transcription primers, Reverse 5’- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3’
Tris-Base	Fisher Scientific	BP152
Tween20	Millipore Sigma	P2287
Equipment
-20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
20 °C incubator	ThermoFisher Scientific
37 °C incubator	Forma Scientific
4 °C refrigerator	ThermoFisher Scientific
-80 °C freezer	Eppendorf
Autoclave	Sanyo
Balch homogenizer, isobiotec cell homogenizer	Isobiotec
Benchtop Vortexer	Fisher Scientific	2215365
Centrifuge, Eppendorf 5418 R	Eppendorf	5401000013
Centrifuge, VWR Clinical 50	VWR International	82013-800
Dissection microscope, Leica M80	Leica Microsystems
Fluorometer, Qubit 2.0	Invitrogen	Q32866
Gel imaging system, iBright FL1500	ThermoFisher Scientific	A44241
Gel system	ThermoFisher Scientific
Heat block	VWR International	12621-048
Microcentrifuges, Eppendorf 5424	Eppendorf	22620401
PIPETBOY acu 2	Integra	155017
Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014382
Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014388
Pipette L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014391
Pipette L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS	Rainin	17014392
Rocking platform	VWR International
Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro	Eppendorf	950030010