JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

세포 없는 시스템을 사용하여 단백질 프로토타이핑을 위한 최소선형 템플릿의 증폭을 위한 신속하고 효소적인 방법

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62728
,
1Chemical and Biological Engineering,Iowa State University

Summary

연구 결과는 복제하거나 살아있는 세포를 사용하지 않고 합성 유전자 단편에서 단백질 검열 캠페인을 위한 DNA의 큰 (μg-mg) 양을 만들기 위한 프로토콜을 기술합니다. 최소 템플릿은 효소적으로 소화되고 원형화된 다음, 이더스말 롤링 서클 증폭을 사용하여 증폭됩니다. 세포 없는 발현 반응은 불정제 된 제품으로 수행 될 수있다.

Abstract

이 프로토콜은 최소한의 DNA 템플릿의 설계와 효소 증폭을 위한 단계를 설명하며, 세포 없는 발현을 사용하여 24시간 이내에 분석 가능한 단백질의 신속한 프로토타이핑을 가능하게 합니다. 공급 업체로부터 DNA를 받은 후 유전자 단편은 PCR 증폭, 절단, 원형 및 저온 뱅크입니다. 소량의 뱅크된 DNA는 이더스롤링 원 증폭(RCA)을사용하여 현저하게 희석되고 증폭됩니다(최대 106x). RCA는 시작 물질의 피코그램 수준에서 최소한의 발현 템플릿의 마이크로그램 양을 얻을 수 있습니다 (모든 시작 합성 단편이 사용되는 경우 mg 수준). 이 작품에서 시작량은 20pg로 최종 제품의 4μg을 초래했습니다. 생성된 RCA 제품(최소 템플릿의 컨카퍼)은 정화 단계가 없는 세포 없는 반응에 직접 추가할 수 있다. 이 방법은 전적으로 PCR 기반이기 때문에 자동화된 액체 처리 시스템과 결합될 때 미래의 고처리량 선별 작업을 가능하게 할 수 있습니다.

Introduction

세포 없는 유전자 발현(CFE)은 많은 응용분야와 함께 강력한 도구로 부상하고 있다. 이러한 응용 분야에는질병 검출1, 2,3,4,5,6,미량 영양소 및 소분자 검출7,8,9,10,11,12,바이오 제조13,14,15,16,17 ,18,교육19,20,21,제조 어려운 단백질17,22,23,24,25,26,27,및 변종 스크리닝23,28,29,30, 31,32 ,33. 이는 셀 프리 시스템의 개방적 특성과 그들이 부여하는 유연성 때문입니다. 많은 훌륭한 리뷰 기사는 기술34,35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44에대한 역사적 교육과 미래의관점을제공합니다.

전형적인 세포 없는 반응은 세포 추출물, 에너지 혼합 및 유전 템플릿의 세 가지 주요 구성 요소로 구성됩니다. 활성 세포 추출물은 전사 및 번역(TXTL)에 필요한 모든 기계를 포함하고 있으며36의다양한 방법으로 처리될 수 있다. 에너지 믹스의 글리코리틱 중급자, 전해질, 아미노산 및 보조인은 TXTL 공정을 지원합니다. 그것은 세포 없는 실험에 있는 가변성의 주요 근원이고45 및 여러 가지 방법으로 제조될 수 있다34,46. 전통적인 복제 방법은 우수한 발현 특성을 가진 플라스미드를 초래하기 때문에 유전 템플릿의 준비는 적은 개선을 보았다. 이러한 전통적인 방법의 단점은 이를 구성하고 전파하는 데 필요한 처리 시간과 생물학적 전문 지식의 양입니다. 최근 최적화 노력으로 인해 에너지 믹스준비49,50과병행하여 수행할 수 있는 세포 추출물준비(47,48)를 위한 간단한 24시간 워크플로우가 발생했습니다. 그러나, 기존의 복제는 CFE 프로토타이핑 타임라인(표1)23에여러 일을 추가한다. 상용 유전자 단편으로부터 PCR 제품을 빠르게 증폭시키는 것은 직접사용할수 있지만, 이는 약 5개의 반응(전통적인 15μL 부피)에 해당하는 DNA의 1μg만 생성되기 때문에 프로토타이핑 실험의 수를 제한한다. 이러한 순환화 및 이더스말 증폭의 추가 단계로, DNA의 밀리그램 수량보다 큰 (~5,000 반응 1 mg). 이것은 극적으로 단백질의 높은 처리량 검열 또는 조합 효소 네트워크 (세포 없는 신진 대사 공학)에서 만들어질 수 있는 시험의 수를 증가시킵니다; 또한 선형 템플릿 라이브러리를 고농도 DNA로 효과적으로 보존할 수 있습니다. 또한 재료 과학 응용 분야(단백질 기반 섬유 및 하이드로겔)에 필요한 대량의 단백질을 시제품화하기 위해 더 많은 양의 템플릿이 필요합니다. 선형 템플릿의 일부 제한은 BL21 DE3 Star에서 추출한 추출을 사용하거나 최근에 발견된 방법을 사용하여 선형 템플릿을 분해52,53,54로부터보호함으로써 극복할 수 있다. 그러나, 이것은 PCR 증폭을 위한 공급 업체 생산 DNA의 제한된 주식을 가진 또는 복제에 필요한 생물학 전문 지식 및 장비의 문제를 다루지 않습니다.

이 작품은 소량의 벤더 생산 유전자 단편(일반적으로 lyophilized 분말의 500-1000 ng ng)에서 얻을 수 있는 발현 템플릿의 양을 증가시키기 위해 명시적으로 설계된 프로토콜을 제시한다. 설명된 방법은 플라스미드에서 전통적인 복제를 수행하거나 살아있는 세포에서 변환 및 전파하는 데 필요한 기술을 필요로하지 않습니다. 메일에서 유전자 단편을 받으면, 사용자는 이더스럽 롤링 원 증폭(RCA)(도 1)23을사용하여 많은 세포 없는 반응에 대한 충분한 템플릿을 생성할 수 있다. 공급 업체로부터 받은 DNA의 양은 제한된 선별 노력에 충분할 수 있지만, 신속하게 고갈되고 유전자 조각을 다시 구입하는 것은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 듭니다. 이 방법은 또한 대장균에서 독성이 있고 복제하기 어려운 유전자에 특히 적합합니다.

Protocol

1. 유전자 단편 설계 참고: 유전자 단편은 프로모터, 리보솜 결합 부위(RBS), 시작 코돈, 관심 유전자 및 종기 작성기를 포함하여 전사/번역에 필요한 모든 유전 적 요소를 가져야합니다. 종결자는 선형 식 템플릿(LET)에 필요하지 않지만 사용자가 플라스미드에 시퀀스를 삽입하기로 결정하는 경우 중요합니다. 이러한 시퀀스는 T7 프로모터를 사용하는 pJL1-sfGFP 플라스미드<sup class="x…

Representative Results

RCA 템플릿으로부터 sfGFP의 발현은 15 μL반응(도 2A)에서무정제 RCA DNA의 0.30 μL만을 사용할 때 pJL1 플라스미드의 것과 비교할 수 있었다. 사실, 템플릿의 양을 두 배로 늘리고 세 배로 늘리면 BL21 DE3 Star 추출물에 아무런 이점이 없는 것으로 보이며, 이는 반응당 0.30 μL로 템플릿의 이미 포화 수준을 시사합니다. 반대로, SHuffle 균주로부터 공급되는 세포 추출물에 첨가할 때 RCA 템?…

Discussion

관심의 유전자는 원하는 단백질이 될 수 있지만, 이 방법의 새로운 채택자를위한 웰 플레이트 판독기에서 실시간 또는 엔드 포인트 판독을위한 편리한 리포터로서 형광 단백질로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 새로운 단백질 서열의 경우 원하는 단백질의 아미노산 서열을 복사하여 원하는 코돈 최적화도구(61,62)에붙여 넣습니다. 코돈 최적화 도구에는 …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 NIH 1R35GM138265-01 및 NSF 2029532 이 프로젝트의 부분적인 지원을 인정합니다.

Materials

Alaline Formedium DOC0102
Ammonium glutamate MP Biomedicals MP21805951
Arginine Formedium DOC0106
Asparagine Formedium DOC0114
Aspartic Acid Formedium DOC0118
ATP Sigma A2383
Axygen Sealing Film Corning PCR-SP
CMP Sigma C1006
Coenzyme A Sigma C3144
CutSmart Buffer NEB B7204S Provided with HindIII
Cysteine Formedium DOC0122
DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4004 Used for purifying DNA
dNTPs NEB N0447
E. coli tRNA Sigma (Roche) 10109541001
Folinic Acid Sigma 47612
Gene Fragment IDT
Glutamic Acid Formedium DOC0134
Glutamine Formedium DOC0130
Glycine Formedium DOC0138
GMP Sigma G8377
HEPES Sigma H3375
HindIII-HF NEB R3104L
Histidine Formedium DOC0142
Isoleucine Formedium DOC0150
Leucine Formedium DOC0154
Lysine Formedium DOC0158
Magnesium glutamate Sigma 49605
Methionine Formedium DOC0166
Microtiter Plate (384 well) Greiner 781906
Microtiter Plate (96 well) Greiner 655809
Multimode Plate Reader BioTek Synergy Neo2
NAD Sigma N8535
NanoPhotometer Implen NP80
OneTaq DNA Polymerase NEB M0480
PCR Tube VWR 20170-012
Phenylalanine Formedium DOC0170
Phosphoenolpyruvate Sigma (Roche) 10108294
Potassium glutamate Sigma G1501
Potassium oxalate Fisher Scientific P273
Proline Formedium DOC0174
Putrescine Sigma P5780
Serine Formedium DOC0178
Spermidine Sigma S0266
T4 DNA Ligase NEB M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer NEB B0202S Provided with T4 DNA Ligase
TempliPhi Amplification Kit Cytiva 25640010 Used for RCA
Thermal Cycler Biorad C1000 Touch
Thermoblock Eppendorf ThermoMixer FP
Threonine Formedium DOC0182
Tryptophan Formedium DOC0186
Tyrosine Formedium DOC0190
UMP Sigma U6375
Valine Formedium DOC0194
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sun, Q., et al. A simple and low-cost paper-based colorimetric method for detecting and distinguishing the GII.4 and GII.17 genotypes of norovirus. Talanta. 225, 121978 (2021).
  2. Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  3. Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  4. Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment. Synthetic Biology. 3 (1), (2018).
  5. Park, S., Lee, J. W. Detection of coronaviruses using rna toehold switch sensors. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1772 (2021).
  6. Cao, M., Sun, Q., Zhang, X., Ma, Y., Wang, J. Detection and differentiation of respiratory syncytial virus subgroups A and B with colorimetric toehold switch sensors in a paper-based cell-free system. Biosensors and Bioelectronics. 182, 113173 (2021).
  7. Mcnerney, M. P., et al. Point-of-care biomarker quantification enabled by sample-specific calibration. Science Advances. 5 (9), (2019).
  8. Silverman, A. D., Akova, U., Alam, K. K., Jewett, M. C., Lucks, J. B. Design and optimization of a cell-free atrazine biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (3), 671-677 (2020).
  9. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTRβ-specific endocrine disruptors. Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).
  10. Garamella, J., Majumder, S., Liu, A. P., Noireaux, V. An adaptive synthetic cell based on mechanosensing, biosensing, and inducible gene circuits. ACS Synthetic Biology. 8 (8), 1913-1920 (2019).
  11. Glasscock, C. J., et al. Dynamic control of pathway expression with riboregulated switchable feedback promoters. ACS Synthetic Biology. 16, (2019).
  12. Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
  13. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  14. Nelson, J. A. D., et al. Hydrofoam and oxygen headspace bioreactors improve cell-free therapeutic protein production yields through enhanced oxygen transport. Biotechnology Progress. 37 (2), 3079 (2020).
  15. Cai, Q., et al. A simplified and robust protocol for immunoglobulin expression in Escherichia coli cell-free protein synthesis systems. Biotechnology Progress. 31 (3), 823-831 (2015).
  16. Ogonah, O. W., Polizzi, K. M., Bracewell, D. G. Cell free protein synthesis: a viable option for stratified medicines manufacturing? A brief history of cell free synthesis systems. Current Opinion in Chemical Engineering. 18, 77-83 (2017).
  17. Zawada, J. F., et al. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Stark, J. C., et al. On-demand biomanufacturing of protective conjugate vaccines. Science Advances. 7 (6), (2021).
  19. Huang, A., et al. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 1-11 (2018).
  20. Stark, J. C., et al. BioBits health: classroom activities exploring engineering, biology, and human health with fluorescent readouts. ACS Synthetic Biology. 8 (5), 1001-1009 (2019).
  21. Stark, J. C., et al. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), 33 (2018).
  22. Shinoda, T., et al. Cell-free methods to produce structurally intact mammalian membrane proteins. Scientific Reports. 6, (2016).
  23. Dopp, J. L., Rothstein, S. M., Mansell, T. J., Reuel, N. F. Rapid prototyping of proteins: Mail order gene fragments to assayable proteins within 24 hours. Biotechnology and Bioengineering. 116 (3), 667-676 (2019).
  24. Sachse, R., Dondapati, S. K., Fenz, S. F., Schmidt, T., Kubick, S. Membrane protein synthesis in cell-free systems: From bio-mimetic systems to bio-membranes. FEBS Letters. 588 (17), 2774-2781 (2014).
  25. Salehi, A. S. M., et al. Cell-free protein synthesis of a cytotoxic cancer therapeutic: Onconase production and a just-add-water cell-free system. Biotechnology Journal. 11 (2), 274-281 (2016).
  26. Georgi, V., et al. On-chip automation of cell-free protein synthesis: New opportunities due to a novel reaction mode. Lab on a Chip. 16 (2), 269-281 (2016).
  27. Thoring, L., et al. Cell-free systems based on CHO cell lysates: Optimization strategies, synthesis of “difficult-to-express” proteins and future perspectives. PLoS One. 11 (9), (2016).
  28. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Simple, functional, inexpensive cell extract for in vitro prototyping of proteins with disulfide bonds. Biochemical Engineering Journal. 164, 107790 (2020).
  29. Isaksson, L., Enberg, J., Neutze, R., Göran Karlsson, B., Pedersen, A. Expression screening of membrane proteins with cell-free protein synthesis. Protein Expression and Purification. 82 (1), 218-225 (2012).
  30. Techner, J. M., et al. High-throughput synthesis and analysis of intact glycoproteins using SAMDI-MS. Analytical Chemistry. 92 (2), 1963-1971 (2020).
  31. Kim, H. C., et al. Implementing bacterial acid resistance into cell-free protein synthesis for buffer-free expression and screening of enzymes. Biotechnology and Bioengineering. 112 (12), 2630-2635 (2015).
  32. Rolf, J., Siedentop, R., Lütz, S., Rosenthal, K. Screening and identification of novel cGAS homologues using a combination of in vitro and in vivo protein synthesis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), (2020).
  33. Haslinger, K., Hackl, T., Prather, K. L. J. Rapid in vitro prototyping of O-methyltransferases for pathway applications in Escherichia coli. bioRxiv. , (2020).
  34. Dopp, J. L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2018).
  35. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user’s guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 24 (2019).
  36. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  37. Chiba, C. H., Knirsch, M. C., Azzoni, A. R., Moreira, A. R., Stephano, M. A. Cell-free protein synthesis: advances on production process for biopharmaceuticals and immunobiological products. BioTechniques. 70, (2021).
  38. Laohakunakorn, N. Cell-free systems: A proving ground for rational biodesign. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 788 (2020).
  39. Dondapati, S. K., Stech, M., Zemella, A., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: A promising option for future drug development. BioDrugs. , 1-22 (2020).
  40. Noireaux, V., Liu, A. P. The new age of cell-free biology. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 51-77 (2020).
  41. Khambhati, K., et al. Exploring the Potential of Cell-Free Protein Synthesis for Extending the Abilities of Biological Systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  42. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  43. Rosenblum, G., Cooperman, B. S. Engine out of the chassis: Cell-free protein synthesis and its uses. FEBS Letters. 588 (2), 261-268 (2014).
  44. Swartz, J. R. Transforming biochemical engineering with cell-free biology. AIChE Journal. 58 (1), 5-13 (2012).
  45. Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
  46. Caschera, F., Noireaux, V. A cost-effective polyphosphate-based metabolism fuels an all E. coli cell-free expression system. Metabolic Engineering. 27, 29-37 (2015).
  47. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-hour workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  48. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of “endotoxin-free” ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  49. Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
  50. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e50762 (2013).
  51. Schinn, S. M., Broadbent, A., Bradley, W. T., Bundy, B. C. Protein synthesis directly from PCR: Progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 480-487 (2016).
  52. Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
  53. Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114, 2137-2141 (2017).
  54. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
  55. . Addgene: pJL1 Available from: https://www.addgene.org/69496/ (2021)
  56. . IDT Codon Optimization Tool Available from: https://www.idtdna.com/pages/tools/codon-optimization-tool (2021)
  57. Hadi, T., et al. Rolling circle amplification of synthetic DNA accelerates biocatalytic determination of enzyme activity relative to conventional methods. Scientific Reports. 10 (1), 10279 (2020).
  58. . New England Biolabs Tm Calculator Available from: https://tmcalculator.neb.com/#!/main (2021)
  59. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, (2010).
  60. Colant, N., et al. A rational approach to improving titer in Escherichia coli-based cell-free protein synthesis reactions. Biotechnology Progress. 37 (1), 3062 (2021).
  61. Burgess-Brown, N. A., et al. Codon optimization can improve expression of human genes in Escherichia coli: A multi-gene study. Protein Expression and Purification. 59, 94-102 (2008).
  62. Maertens, B., et al. Gene optimization mechanisms: A multi-gene study reveals a high success rate of full-length human proteins expressed in Escherichia coli. Protein Science. 19 (7), 1312-1326 (2010).
  63. Eckert, K. A., Kunkel, T. A. DNA polymerase fidelity and the polymerase chain reaction. Genome Research. 1 (1), 17-24 (1991).
  64. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  65. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2005).
  66. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58882 (2019).
  67. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, (2015).

Tags

Keywords: Cell-free SystemsProtein PrototypingRolling Circle AmplificationPCRDNA TemplateRestriction DigestionDNA LigationEnzymatic Amplification
check_url/fr/62728?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, Enzymatic Methods for Amplification of Minimal, Linear Templates for Protein Prototyping using Cell-Free Systems. J. Vis. Exp. (172), e62728, doi:10.3791/62728 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image