ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לכמת ולייצר תמונות דינמיות של תאי גזע מזנכימליים (MSC) רגולציה מתווכת של מקרופאגים (MΦ) פאגוציטוזיס של חלקיקי שמרים לא אוסונים (זימוסן) המצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH.
Abstract
תאי גזע Mesenchymal (MSC) נחקרו באופן מסורתי עבור תכונות התחדשות שלהם, אבל לאחרונה, המאפיינים החיסוניים שלהם היו בחזית. הם מתקשרים ומווסתים את פעילות תאי החיסון. המוקד של מחקר זה הוא הרגולציה MSC של פעילות פגוציטית מקרופאג ‘. פאגוציטוזיס מקרופאג’ (MΦ) הוא חלק חשוב מהתגובה המולדת של מערכת החיסון לזיהום, והמנגנונים שבאמצעותם MSC לווסתים תגובה זו נמצאים תחת חקירה פעילה. מוצג כאן היא שיטה לחקור MΦ phagocytosis של חלקיקי זימוסן לא אוזונסה מצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH בזמן שהם נמצאים בתרבית משותפת עם MSC. ככל שהפעילות הפגוציטית גדלה וחלקיקי הזימוסן המסומנים סגורים בסביבה החומצית של הפגוליסום, עוצמת הפלואורסצנטיות של המולקולה הרגישה ל- pH עולה. עם אורכי הגל המתאימים של עירור ופליטה, פעילות פאגוציטית נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי ונתונים קינטיים מוצגים כשינויים ביחידות פלואורסצנטיות יחסית על פני תקופה של 70 דקות. כדי לתמוך בנתונים כמותיים אלה, השינוי בפעילות הפאגוציטית מוצג באופן חזותי באמצעות הדמיה דינמית. תוצאות בשיטה זו מראות כי כאשר בתרבות משותפת, MSC לשפר MΦ phagocytosis של זימוסן לא opsonized של נאיבי ו IFN-γ מטופל MΦ. נתונים אלה מוסיפים לידע הנוכחי של ויסות MSC של המערכת החיסונית המולדת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בחקירות עתידיות כדי לתוות באופן מלא את המנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים.
Introduction
תאי גזע מזנכימליים (MSC) הם תאי אבות המעוררים תאי רקמת חיבור. MSC נמצאים ברקמות יונקים בוגרים וניתן לבודדם ממח העצם1. בשל תכונות האימונומודולטוריות שלהם, תאים אלה נחקרים באופן נרחב2. מחקרים מוקדמים התמקדו בוויסות MSC של תאי T3,4,5,6 אבל לאחרונה, הרגולציה שלהם של תאי מקרופאגים (MΦ), מרכיב תאי מרכזי של חסינות מולדת, קיבל תשומת לב מוגברת7,8,9,10,11,12,13,14 . החשיבות של אינטראקציה MSC-MΦ בטיפול במחלות דלקתיות מודגמת על ידי העובדה כי דלדול של מונוציטים / מקרופאגים שולל את ההשפעות הטיפוליות של MSC במודלים בעלי חיים8. כאן, המוקד הוא אינטראקציית הקשר הסלולרי של MSC עם MΦ. MSC יש את היכולת לווסת את הפנוטיפ של MΦ על ידי קידום המעבר מתגובות דלקתיות לאנטי דלקתיות, המוביל לפעילויותתיקון רקמות 8,9,10,11, והרבה נעשה כדי להדגים מנגנוני רגולציה אלה. בנסיבות אחרות, MSC יכול לתמוך או להחמיר תגובה דלקתית מונעת MΦ12,13 ולשפר את הפעילות הפאגוציטית MΦ14,15. עם זאת, קיים מחסור קריטי בנתונים קיימים המזהים את המנגנונים לפיהם ואת התנאים שבהם MSC מסדיר את הפעילות הפאגוציטית MΦ.
MΦ יש משפחות של קולטנים המזהים אופוסונום (נוגדן או משלים מצופה) או פתוגנים שאינם אובזוניים המובילים phagocytosis16. ההפעלה והפעילות של האחרון הוא פחות נחקר היטב17. בסביבה לא דלקתית במבחנה, MSC לשפר MΦ phagocytosis של פתוגנים שאינם אוסוניסטים13. עם זאת, זיהוי של פתוגנים שאינם opsonized על ידי MΦ עשוי להיות מופחת לאחר חשיפה לסביבה דלקתית המיוצר על ידי לימפוציטים במהלך תגובה חיסונית אדפטיבית. IFN-γ, שוחרר על ידי תאי רוצח טבעי לימפוציטים אפקט, יש השפעה מעכבת על MΦ phagocytosis של חלקיקים לא opsonized18. מודל תרבות משותפת פותח כדי ללמוד את המנגנונים של MSC רגולציה מגע ישיר של MΦ phagocytosis. מטרת הניסוי המוצג כאן היא לקבוע אם MSC לווסת MΦ phagocytosis של פתוגנים שאינם אוסוניסטים לאחר MΦ נחשפו IFN-γ (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
ניתוח של פאגוציטוזיס באמצעות חלקיקים ביולוגיים הצומדים לצבע רגיש ל- pH הוא כלי חדש יחסית שהוכיח יתרון על פני חלקיקים מסורתיים המסומנים פלואורסצנטית12,19,20. עם חלקיקים מסורתיים המסומנים בפלואורסצנט, רק ניתוח נקודת קצה אפשרי. הזיהוי מתבצע בא?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מנגנון מכשיר המחקר העיקרי של NSF תחת מספרי מענקים 1626093 1919583.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
