एक हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल लाइन इन विट्रो में शॉर्ट हेयरपिन आरएनए-मध्यस्थता जीन नॉकडाउन द्वारा डेंड्राइटिक सेल विकास का अध्ययन
Summary
यहां हम इन विट्रो डीसी भेदभाव के लिए स्थिर नॉकडाउन सेल लाइनों को प्राप्त करने के लिए shRNA के लेंटिवारल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके डेंड्राइटिक सेल (डीसी) के विकास में शामिल संभावित प्रतिलेखन कारकों की स्क्रीनिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
Abstract
डेंड्राइटिक कोशिकाएं (डीसी) महत्वपूर्ण एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं हैं जो जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को जोड़ती हैं। डीसी विषम हैं और इन्हें पारंपरिक डीसी (सीडीसी) और प्लाज्मासाइटोइड डीसी (पीडीसी) में विभाजित किया जा सकता है। cDCs करने के लिए एंटीजन प्रस्तुत करने और भोले टी कोशिकाओं को सक्रिय करने में माहिर हैं. दूसरी ओर, पीडीसी वायरल संक्रमण के दौरान बड़ी मात्रा में टाइप I इंटरफेरॉन (IFN-I) का उत्पादन कर सकते हैं। डीसी का विनिर्देश अस्थि मज्जा (बीएम) में डीसी पूर्वजों के प्रारंभिक चरण में होता है और प्रतिलेखन कारकों (टीएफ) के नेटवर्क द्वारा परिभाषित किया जाता है। उदाहरण के लिए, cDCs अत्यधिक व्यक्त ID2, जबकि pDCs अत्यधिक E2-2 व्यक्त करते हैं। चूंकि डीसी के अधिक से अधिक सबसेट की पहचान की जा रही है, इसलिए डीसी विकास को नियंत्रित करने वाले विशिष्ट टीएफ को समझने में रुचि बढ़ रही है। यहां, हम एक अमर हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज सेल (आईएचएसपीसी) लाइन में छोटे हेयरपिन आरएनए (shRNA) को ले जाने वाले लेंटीवायरस को वितरित करके विट्रो में डीसी भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण टीएफ को स्क्रीन करने के लिए एक विधि स्थापित करते हैं। चयन और इन विट्रो भेदभाव के बाद, स्थिर नॉकडाउन सेल लाइनों की सीडीसी और पीडीसी क्षमता का विश्लेषण फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया जाता है। यह दृष्टिकोण विट्रो में पूर्वजों से संभावित रूप से डीसी भाग्य को नियंत्रित करने वाले जीन की पहचान करने के लिए एक मंच प्रदान करता है।
Introduction
डीसी जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा 1 के प्रमुख नियामक हैं। डीसी को मुख्य रूप से दो कार्यात्मक रूप से अलग-अलग आबादी में वर्गीकृत किया जाता है, अर्थात् पीडीसी और सीडीसी। इसके अलावा, cDCs में दो सबसेट शामिल हैं, अर्थात्, टाइप I और टाइप II cDCs या cDC1s और cDC2s, क्रमशः। पीडीसी, बीएसटी 2, सिग्लेक-एच, और चूहों 3, 4 में सीडी 11 सी के मध्यवर्ती स्तरों को व्यक्त करते हुए, कोशिकाएं हैं जो सूजन और वायरल संक्रमण 5 के दौरान बड़ी मात्रा में आईएफएन-आई का स्राव कर सकती हैं। उनकी मजबूत आईएफएन-आई-उत्पादक क्षमता के कारण, उन्हें ऑटोइम्यून बीमारियों की प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने का भी संदेह है, जिसमें प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोसस (एसएलई) 6 शामिल हैं। cDC1s, XCR1, CD8a, CLEC9A, और MICE7 में CD103 की सतह अभिव्यक्ति द्वारा परिभाषित, एंटीजन क्रॉस-प्रस्तुति के माध्यम से साइटोटोक्सिक CD8 + T कोशिकाओं (CTLs) के सक्रियण और ध्रुवीकरण में विशिष्ट हैं, जिससे इंट्रासेल्युलर रोगजनकों और कैंसर 8,9 के जवाब में प्रकार I प्रतिरक्षा शुरू होती है। दूसरी ओर, CDC2s, दोनों मनुष्यों और चूहों में CD11b और CD172α (जिसे Sirpα के रूप में भी जाना जाता है) को व्यक्त करते हुए, CD4 + T कोशिकाओं को सक्रिय कर सकते हैं और एलर्जीन और परजीवी 10 के खिलाफ टाइप II प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ावा दे सकते हैं, साथ ही साथ बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया और माइक्रोबायोटा मान्यता 11,12 के बाद प्रकार III प्रतिरक्षा को संशोधित कर सकते हैं।
डीसी का विविधीकरण BM में हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (HSPCs) से TFs के एक समूह द्वारा निर्धारित किया जाता है। E2-2 (Tcf4 द्वारा एन्कोडेड) pDCs13,14 के विभेदन और कार्य के लिए एक मास्टर नियामक है। इसके विपरीत, डीएनए बाइंडिंग 2 (आईडी 2) का अवरोधक सीडीसी विनिर्देश को चलाता है और ई प्रोटीन गतिविधि को अवरुद्ध करने के माध्यम से पीडीसी विकास को रोकता है। इसके अलावा, cDC1s के विकास के लिए IRF8 और BATF3 की आवश्यकता होती है, जबकि cDC2s का विभेदन अत्यधिक IRF416 पर निर्भर करता है। हाल के कार्यों ने pDCs17 और cDCs की विषमता और उनके ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन 18 का पता लगाया है। डीसी नेटवर्क की जटिलता के कारण, डीसी के विकास और कार्यक्षमता को नियंत्रित करने वाले अन्य टीएफ की पहचान करने के लिए एक मंच स्थापित करने की आवश्यकता है।
यहां, हमने एक आईएचएसपीसी का उपयोग किया जो बीएम कोशिकाओं में होक्सबी 8 के एस्ट्रोजन-विनियमित परमाणु स्थानांतरण को व्यक्त करके उत्पन्न किया गया था (जिसे होक्सबी 8-एफएल कोशिकाओं के रूप में भी जाना जाता है) 19। iHSPCs β-एस्ट्राडियोल और Flt3 लिगैंड (FL) की उपस्थिति में एक अविभाजित चरण में फैल सकते हैं और रह सकते हैं, जबकि वे β-एस्ट्राडियोल 19 की वापसी पर FL की उपस्थिति में विभिन्न डीसी प्रकारों में अंतर करना शुरू करते हैं। इस विशेषता के आधार पर, हम पूर्वज चरण में ब्याज के जीन को खटखटा सकते हैं, इसके बाद पीडीसी और सीडीसी के इन विट्रो भेदभाव पर प्रभाव की जांच कर सकते हैं। इसलिए, यह विधि उन जीनों की खोज करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है जो डीसी के विकास और कार्य को विनियमित करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
लेंटिवायरस-आधारित एसएचआरएनए वैक्टर का उपयोग अक्सर कोशिकाओं में वायरल ट्रांसडक्शन द्वारा जीन मौन के लिए किया जाता है और मेजबान जीनोम में स्थिर एकीकरण की अनुमति देता है। हालांकि, विभिन्न सेल प्रकारों …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डॉ Tz-Ling चेन से तकनीकी सहायता के लिए आभारी हैं। हम shRNA lentivirus (http://rnai.genmed.sinica.edu.tw) प्रदान करने के लिए राष्ट्रीय आरएनएई कोर सुविधा (अकादमिक Sinica, ताइवान) को धन्यवाद देते हैं। इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान (MOST 108-2320-B-002-037-MY3 और MOST 109-2320-B-002-054-MY3) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Antibodies | |||
| APC/Cy7 anti-mouse CD11c Antibody | Biolegend | 117324 | (Clone: N418) |
| FITC anti-mouse/human CD11b Antibody | Biolegend | 101206 | (Clone: M1/70) |
| PE anti-mouse/human B220 Antibody | Biolegend | 103208 | (Clone: RA3-6B2) |
| Cell culture | |||
| 1.5 mL Micro tube | ExtraGene | TUBE-170-C | |
| 12-well tissue culture-treated plate | Falcon | 353043 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| RPMI 1640 medium | gibco | 11875-085 | |
| Reagent | |||
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758-250MG | |
| β-mercaptoethanol (β-ME) | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| FACS buffer | home-made | Formula: 1xPBS+0.5 %FBS+0.1%NaN3 | |
| Flt3 ligand (FL) | home-made | ||
| Polybrene | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| Puromycin | Invivogen | ant-pr-1 | |
| TRIsure | BIOLINE | BIO-38032 | |
| shRNA (Taregt sequence/clone ID) | Company | ||
| shId2 (GCTTATGTCGAATGATAGCAA/TRCN0000054390) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shLacZ (CGCGATCGTAATCACCCGAGT/TRCN0000072224) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
| shTcf4 (GCTGAGTGATTTACTGGATTT/TRCN0000012094) | The RNAi Consortium (TRC) | ||
References
- Steinman, R. M., Witmer, M. D. Lymphoid dendritic cells are potent stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 75 (10), 5132-5136 (1978).
- Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature Reviews Immunology. 14 (8), 571-578 (2014).
- Blasius, A. L., Cella, M., Maldonado, J., Takai, T., Colonna, M. Siglec-H is an IPC-specific receptor that modulates type I IFN secretion through DAP12. Blood. 107 (6), 2474-2476 (2006).
- Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunology Reviews. 234 (1), 142-162 (2010).
- Liu, Y. -. J. IPC: Professional Type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annual Review of Immunology. 23 (1), 275-306 (2005).
- Panda, S. K., Kolbeck, R., Sanjuan, M. A. Plasmacytoid dendritic cells in autoimmunity. Current Opinion in Immunology. 44, 20-25 (2017).
- Durai, V., Murphy, K. M. Functions of murine dendritic cells. Immunity. 45 (4), 719-736 (2016).
- Mashayekhi, M., et al. CD8α(+) dendritic cells are the critical source of interleukin-12 that controls acute infection by Toxoplasma gondii tachyzoites. Immunity. 35 (2), 249-259 (2011).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. -. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Plantinga, M., et al. Conventional and monocyte-derived CD11b(+) dendritic cells initiate and maintain T helper 2 cell-mediated immunity to house dust mite allergen. Immunity. 38 (2), 322-335 (2013).
- Persson, E. K., et al. IRF4 transcription-factor-dependent CD103(+)CD11b(+) dendritic cells drive mucosal T helper 17 cell differentiation. Immunity. 38 (5), 958-969 (2013).
- Kumamoto, Y., et al. CD301b+ dermal dendritic cells drive T helper 2 cell-mediated immunity. Immunity. 39 (4), 733-743 (2013).
- Cisse, B., et al. Transcription factor E2-2 is an essential and specific regulator of plasmacytoid dendritic cell development. Cell. 135 (1), 37-48 (2008).
- Grajkowska, L. T., et al. Isoform-specific expression and feedback regulation of E protein TCF4 control dendritic cell lineage specification. Immunity. 46 (1), 65-77 (2017).
- Jackson, J. T., et al. Id2 expression delineates differential checkpoints in the genetic program of CD8α+ and CD103+ dendritic cell lineages. The EMBO Journal. 30 (13), 2690-2704 (2011).
- Suzuki, S., et al. Critical roles of interferon regulatory factor 4 in CD11bhighCD8alpha- dendritic cell development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 101 (24), 8981-8986 (2004).
- Rodrigues, P. F., et al. Distinct progenitor lineages contribute to the heterogeneity of plasmacytoid dendritic cells. Nature Immunology. 19 (7), 711-722 (2018).
- Brown, C. C., et al. Transcriptional basis of mouse and human dendritic cell heterogeneity. Cell. 179 (4), 846-863 (2019).
- Redecke, V., et al. Hematopoietic progenitor cell lines with myeloid and lymphoid potential. Nature Methods. 10 (8), 795-803 (2013).
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Polybrene increases the efficiency of gene transfer by lipofection. Gene Therapy. 5 (5), 708-711 (1998).
- Sorgi, F. L., Bhattacharya, S., Huang, L. Protamine sulfate enhances lipid-mediated gene transfer. Gene Therapy. 4 (9), 961-968 (1997).
- Kirkling, M. E., et al. Notch signaling facilitates in vitro generation of cross-presenting classical dendritic cells. Cell Reports. 23 (12), 3658-3672 (2018).
- Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nature Reviews. Immunology. 15 (1), 18-29 (2015).
- Wculek, S. K., Khouili, S. C., Priego, E., Heras-Murillo, I., Sancho, D. Metabolic Control of Dendritic Cell Functions: Digesting Information. Frontiers in Immunology. 10 (775), (2019).
- Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
