使用双氟比度显微镜测量巨无素体的pH值、重度化学和降解能力
Summary
我们描述了测量活细胞中单个巨细胞体中的pH值、氧化事件和蛋白质消化的方案。强调双氟比显微镜及其提供的优势，而不是基于人群的技术。
Abstract
近年来，巨脊细胞病领域发展迅速。巨脊细胞增多已成为先天免疫细胞维持有机体平衡和免疫的中心机制。同时，与其家庭静止作用相反，它也可以驱动各种病理学，包括癌症和病毒感染。与其他内分泌模式不同，为研究巨细胞体成熟性而开发的工具仍然不发达。在这里，协议描述了新开发的工具，用于研究早期和成熟的巨皮诺体的流明中的氧化物环境。介绍了在评估pH值、活性氧物种的产生以及活细胞中单个巨细胞的流明内的降解能力时使用比例荧光显微镜的方法。单个细胞器测量具有揭示空间异质性的优势，而空间异质性往往因基于人口的方法而消失。强调双荧光比显微镜的基本原则，包括探头选择、仪器、校准和单细胞对人群的方法。
Introduction
巨细胞增多症是指将大量细胞外液体吸收到膜结合的细胞质细胞体中，称为巨细胞体1、2。这是一个高度保守的过程，由自由生活的单细胞生物，如阿米巴Dictyostelium孢子执行。3，以及安托佐安4和元子2。在大多数细胞中，巨脊细胞增多是一种诱发事件。细胞表面受体的结合诱导了作用素驱动的等离子膜延伸（称为褶皱）的突出。其中一小部分褶皱，通过一些不为人知的机制，密封在他们的远角提示形成巨无边（虽然超出了本方法论文的范围，对巨脊细胞增多的机制进行详细审查，请参阅参考文献1，2，5，6，7）。细胞外刺激诱导巨脊细胞增多，往往是可溶性生长因子5，8。因此，宏脊细胞事件允许摄入细胞外物质，细胞可以从中获得有用的代谢物，以促进生长。不幸的是，这种营养输送途径也可以驱动病理学。某些癌细胞会产生突变，导致持续或构成性巨脊细胞增多。营养物质的连续输送有助于癌细胞不受控制的增殖，并且与特别具有攻击性的肿瘤9、10、11、12、13有关。同样，病毒可以诱导巨脊细胞增多，从而获得宿主细胞，从而推动病毒病理学14。
巨脊细胞增多症也起到维持对病原体免疫力的作用。某些先天免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，通过巨细胞细胞增多症6、15、16进行细胞外液体的构成和侵略性采样。这种巨细胞细胞增多的模式是令人难以置信的活跃，一个单一的树突状细胞可以吞噬自己与细胞外液体的体积相当于它自己的重量每小时17。尽管有这种构成采样，巨噬细胞和树突状细胞并没有像肿瘤细胞那样无法控制地复制，相反，它们似乎处理细胞外物质的方式可以提取信息，以告知存在或确实不存在潜在威胁。信息提取为 i） 病原体相关的分子模式，可以通过细胞内病原体识别受体和 ii） 短段氨基酸，可以加载到主要组织相容性分子上，由自适应免疫系统的细胞筛选16，18，19。病原体是否颠覆了免疫细胞信息处理的途径，目前尚不清楚。
尽管这些定义明确和关键的作用，为宏脊柱侧体在维持免疫力和平衡，与其他更常见的研究模式的内分泌，很少的宏观皮诺索的内部（发光）工作是已知的。开发标准化的协议和工具来研究巨脊质素的发光生物化学，不仅有助于我们更好地了解它们独特的生物学，而且将提供见解，可用于新的治疗策略，包括药物输送20。这种方法手稿将侧重于最近开发的工具，在单一细胞层解剖巨细胞素的发光生物化学的各个方面。
荧光素可用于测量细胞器的特定生物化学，如果 i） 它们优先划分到兴趣隔间和/或 ii） 它们根据兴趣参数进行光谱变化。例如，在 pH 的情况下，荧光弱碱基，如青紫橙、新月紫罗兰和莱索跟踪染料优先积聚在酸性有机体中。因此，它们的相对强度是标记的细胞器是酸性的粗略迹象。其他pH响应荧光素，如荧光素、pHrodo和环丙烯，在与质子结合时会发生光谱变化（图1A-C）。因此，对pH敏感的荧光素的荧光发射的变化可以提供pH值的有用近似值。然而，单氟的使用存在一些缺点。例如，焦点平面的变化、光模糊和单个细胞体积的变化，在巨细胞体21中很常见，可诱发单个荧光素的荧光强度变化，而这不能轻易纠正为22。因此，单波长评估虽然有助于可视化酸性隔间，但纯粹是定性的。
更定量的方法是瞄准参数敏感的荧光，以及参考荧光素到感兴趣的细胞器。参考荧光对细胞内的生化变化（图1D-F）理想情况下不敏感，因此可用于纠正焦点平面、风琴体积的变化，以及在某种程度上光出血23。使用这种称为双荧光比的方法，可以通过生成参数敏感荧光的荧光排放与参考荧光的比例来实现校正。
在这里，协议将利用双氟比度成像原理来测量大皮诺索体内的pH值、氧化事件和蛋白质降解。在每种情况下，都会选择对兴趣参数和参考氟磷敏感的荧光素。为了将荧光素专门针对巨皮诺索，它们将共价耦合到70kDa dextran，优先地整合到大皮诺索24中。所有检测将在 Raw264.7 细胞中执行，但可以适应其他细胞类型。在可能的情况下，荧光比将根据参考曲线校准以获得绝对值。重要的是，所有测量将在活细胞中进行，以便对巨细胞体的亮度环境进行动态和定量评估。
在选择pH敏感荧光时，必须权衡一些考虑因素。第一个是荧光素的pKa，它表示探测器最敏感的pH值范围。如果假定在形成后不久，巨氨酸体的pH值将接近细胞外介质（+pH 7.2），并且它将通过与晚期内分泌体和溶酶体（+pH 5.0）的相互作用逐渐酸化，那么应选择具有pKa的探针，该探针在该范围内是敏感的（图2C）。氟氟素的pKa为6.4，在这个范围内具有最佳敏感性。它已被广泛用于测量其他类似的细胞器，如噬菌体，并将成为荧光在这份手稿22，25选择。作为氟的参考，将使用四甲基钠胺，这是麻木不仁的pH值（图1E）。其他氟，如普罗多和环丙烯可以替代荧光素，其中荧光素的光谱特性确实与其他实验变量匹配。一些建议参考氟为 pHrodo 和环孢子 5e 显示在图 1中。
第二个考虑因素是将这两种荧光素专门针对巨皮诺体的方法。70 kDa大小的Dextran，其水动力学半径约为7纳米，不粘在细胞上，并纳入巨无霸，但不是单体涂层坑或洞穴，因此标记巨无霸（图2A和图3A，B）16，24，26。在本协议中，荧光素标签的 70 kDa dextran 和四甲基钠 （TMR） 标记的 70 kDa dextran 将分别用作 pH 敏感和参考探头。
在先天免疫细胞中，巨脊细胞增多和噬菌体病是外源物质内化加工和随后向适应性免疫反应细胞呈现的两条主要途径。对噬菌体和巨皮诺体流明的氧化化学进行仔细和协调的控制，对于外源材料的上下文特定处理至关重要。也许在噬菌体中研究最充分的氧化事件调节器是NADPH氧化酶，这是一种大型多亚子综合体，在噬菌体28的流明内产生大量的活性氧物种（ROS）。事实上，其活性是适当抗原处理在噬菌体29，30的核心。然而，尚未探索大皮诺体膜上NADPH氧化酶的活性。
在此协议中，H2DCFDA 苏奇尼米尔酯用于测量宏皮诺体内的氧化事件。这是一种经过改良的荧光素（2’，7′-二氯二氢氟氯乙烯二甲酸酯），其减少形式是极小的荧光。氧化后，其荧光排放显著增加。然而，值得注意的是，H2DCFDA的一个重要警告 – 因为它是基于荧光素，它的荧光也淬火在酸性隔间，并必须注意控制这个变量时，设计实验28。与pH值测量方法类似，H2DCFDA苏奇尼米尔酯将共价连接到70kDa dextran，TMR标签的70kDa dextran将用作参考氟（图3A）。
荧光椭圆蛋白将用于测量宏皮诺索体内的蛋白质降解。这里使用的椭圆形布明被密集地标有自淬火的 4，4-二氟-4 波拉-3a，4a-迪亚扎-s-indacene （BODIPY） FL 染料。消化后，强荧光染料标签肽被解放。由于椭圆形布明不能轻易结合到 70 kDa dextran，带有 TMR 标记为 70 kDa dextran 的细胞和流体相椭圆形布明将共同孵育。TMR 信号将用于在成像后分析期间生成宏氨对数面膜，从消化的椭圆形布明中释放的信号将在掩膜内测量（图 3B）。
Protocol
Representative Results
Discussion
虽然在巨噬细胞、成纤维细胞甚至Dictyostelium spp中，对于宏观脊细胞吸收的低透率和高通量测量有许多协议。3，7，31，32，33， 很少尝试测量这些动态舱的发光生物化学。这可能是由于探针的缺乏，可以有效地瞄准大皮诺体隔间，同时避免其他内分泌隔间。这里描述的…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢卡尔加里大学的支持。我们还要感谢罗宾·耶茨博士获得试剂、设备和有益的讨论。
Materials
| Black-walled 96 well plate | PerkinElmer | 6005430 | |
| CypHer5e, NHS ester | Cytiva | PA15401 | |
| Dextran-amino 70 kDa | Invitrogen | D1862 | |
| DQ-ovalbumin | Invitrogen | D12053 | |
| FITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1823 | |
| HBSS | Gibco | 14287 | |
| Nigericin | Sigma Aldrich | N7143 | |
| OxyBurst Green-SE | Invitrogen | D2935 | |
| pHrodo Red, SE | Invitrogen | P36600 | |
| Raw264.7 cells | ATCC | TIB-71 | |
| RPMI medium | Gibco | 11875093 | |
| SP5 Confocal Microscope | Leica | – | |
| TRITC-dextran 70 kDa | Invitrogen | D1819 | |
| u-Dish | Ibidi | 81156 |
References
- Canton, J. Macropinocytosis: New insights into its underappreciated role in innate immune cell surveillance. Frontiers in Immunology. 9, (2018).
- Marques, P. E., Grinstein, S., Freeman, S. A. SnapShot: Macropinocytosis. Cell. 169, 766 (2017).
- Williams, T., Kay, R. R. High-throughput measurement of Dictyostelium discoideum macropinocytosis by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (139), e58434 (2018).
- Ganot, P., et al. Ubiquitous macropinocytosis in anthozoans. eLife. 50022, (2020).
- Charpentier, J. C., et al. Macropinocytosis drives T cell growth by sustaining the activation of mTORC1. Nature Communications. 11, 180 (2020).
- Bohdanowicz, M., et al. Phosphatidic acid is required for the constitutive ruffling and macropinocytosis of phagocytes. Molecular Biology of the Cell. 24, 1700-1712 (2013).
- Commisso, C., Flinn, R. J., Bar-Sagi, D. Determining the macropinocytic index of cells through a quantitative image-based assay. Nature Protocols. 9, 182-192 (2014).
- Yoshida, S., Pacitto, R., Sesi, C., Kotula, L., Swanson, J. A. Dorsal ruffles enhance activation of Akt by growth factors. Journal of Cell Science. 131, (2018).
- Commisso, C., et al. Macropinocytosis of protein is an amino acid supply route in Ras-transformed cells. Nature. 497, 633-637 (2013).
- Commisso, C. The pervasiveness of macropinocytosis in oncological malignancies. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Sciences. 374, 20180153 (2019).
- Zhang, Y., et al. Macropinocytosis in cancer-associated fibroblasts is dependent on CaMKK2/ARHGEF2 signaling and functions to support tumor and stromal cell fitness. Cancer Discovery. , (2021).
- Lee, S. -. W., et al. EGFR-Pak signaling selectively regulates glutamine deprivation-induced macropinocytosis. Developmental Cell. 50, 381-392 (2019).
- Michalopoulou, E., et al. Macropinocytosis renders a subset of pancreatic tumor cells resistant to mTOR inhibition. Cell Reports. 30, 2729-2742 (2020).
- Mercer, J., Helenius, A. Virus entry by macropinocytosis. Nature Cell Biology. 11, 510-520 (2009).
- West, M. A., et al. Enhanced dendritic cell antigen capture via toll-like receptor-induced actin remodeling. Science. 305, 1153-1157 (2004).
- Canton, J., et al. Calcium-sensing receptors signal constitutive macropinocytosis and facilitate the uptake of NOD2 ligands in macrophages. Nature Communications. 7, 11284 (2016).
- Sallusto, F., Cella, M., Danieli, C., Lanzavecchia, A. Dendritic cells use macropinocytosis and the mannose receptor to concentrate macromolecules in the major histocomaptibility complex class II compartment: downregulation by cytokines and bacterial products. Journal of Experimental Medicine. 182, 389-400 (1995).
- Bhosle, V. K., et al. SLIT2/ROBO1-signaling inhibits macropinocytosis by opposing cortical cytoskeletal remodeling. Nature Communications. 11, 4112 (2020).
- Liu, Z., Roche, P. A. Macropinocytosis in phagocytes: regulation of MHC class-II-restricted antigen presentation in dendritic cells. Frontiers in Physiology. 6, 1 (2015).
- Desai, A. S., Hunter, M. R., Kapustin, A. N. Using macropinocytosis for intracellular delivery of therapeutic nucleic acids to tumour cells. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180156 (2019).
- Freeman, S. A., et al. Lipid-gated monovalent ion fluxes regulate endocytic traffic and support immune surveillance. Science. 367, 301-305 (2020).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring phagosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1519, 185-199 (2017).
- Cheung, S., Greene, C., Yates, R. M. Simultaneous analysis of multiple lumenal parameters of individual phagosomes using high-content imaging. Methods Molecular Biology. 1519, 227-239 (2017).
- Li, L., et al. The effect of the size of fluorescent dextran on its endocytic pathway. Cell Biology International. 39, 531-539 (2015).
- Canton, J., Grinstein, S. Measuring lysosomal pH by fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 126, 85-99 (2015).
- Armstrong, J. K., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Fisher, T. C. The hydrodynamic radii of macromolecules and their effect on red blood cell aggregation. Biophysical Journal. 87, 4259-4270 (2004).
- Blum, J. S., Wearsch, P. A., Cresswell, P. Pathways of antigen processing. Annual Reviews of Immunology. 31, 443-473 (2013).
- Canton, J., Khezri, R., Glogauer, M., Grinstein, S. Contrasting phagosome pH regulation and maturation in human M1 and M2 macrophages. Molecular Biology of the Cell. 25, 3330-3341 (2014).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112, 4712-4722 (2008).
- Canton, J., et al. The receptor DNGR-1 signals for phagosomal rupture to promote cross-presentation of dead-cell-associated antigens. Nature Immunology. 22, 140-153 (2021).
- Mishra, R., Bhowmick, N. A. Visualization of macropinocytosis in prostate fibroblasts. Bio-Protocol. 9, (2019).
- Galenkamp, K. M. O., Alas, B., Commisso, C. Quantitation of macropinocytosis in cancer cells. Methods in Molecular Biology. 1928, 113-123 (2019).
- Lee, S. -. W., Alas, B., Commisso, C. Detection and quantification of macropinosomes in pancreatic tumors. Methods in Molecular Biology. 1882, 171-181 (2019).
- Swanson, J. A., King, J. S. The breadth of macropinocytosis research. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences. 374, 20180146 (2019).
