in vivoアプリケーションのためのナリンゲニン溶液の調製
Summary
ここで、プロトコルは、 インビボ 腹腔内投与のためのナリンゲニン溶液の調製を提示する。ナリンゲニンは、ジメチルスルホキシド、トゥイーン80、および生理食塩水の混合物に完全に溶解します。ナリンゲニンの抗糖尿病性骨粗鬆症効果は、血糖値検査、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ染色、および酵素結合免疫吸着アッセイによって評価されました。
Abstract
化合物(ファイトケミカル)溶液の調製は、薬物スクリーニングなどの研究に適用する前に見過ごされていますが重要なステップです。化合物の完全な可溶化は、その安全な使用および比較的安定した結果のために必要です。ここでは、高脂肪食およびストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病モデルにおけるナリンゲニン溶液およびその腹腔内投与を調製するためのプロトコルが例として実証される。少量のナリンゲニン(3.52〜6.69 mg)を使用して、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および生理食塩水(PS)で再構成されたDMSOとTween 80を含む溶媒への可溶化をテストしました。化合物の完全な可溶化は、溶液の色、遠心分離後の沈殿物の存在(2000 x g で30秒間)、または溶液を室温(RT)で2時間放置することによって決定されます。安定した化合物/ファイトケミカル溶液を得た後、 in vivo 研究に必要な化合物の最終濃度/量を溶媒のみ(PSなし)のストック溶液で調製し、必要に応じてPSで希釈/混合することができます。マウスにおけるナリンゲニンの抗糖尿病性骨粗鬆症効果(20 mg / kg b.w.、2 mg / mLでの腹腔内投与)は、血糖値、骨量(マイクロCT)、および骨吸収率(TRAP染色およびELISA)を測定することによって評価されました。.詳細な有機/植物化学溶液調製物を探している研究者は、この技術の恩恵を受けるでしょう。
Introduction
薬物スクリーニングのための植物化学物質の使用に関する研究の増加に伴い、それらの最適な効果を評価するために植物化学溶液を調製するアプローチは注目に値する。化合物1を調製する際には、溶解方法、投与量、濃度などの多くの側面を考慮する必要があります。
溶媒系溶解は、有機化合物調製1に広く用いられている。一般的に使用される溶媒には、水、油、ジメチルスルホキシド(DMSO)、メタノール、エタノール、ギ酸、トゥイーン、グリセリンなどが含まれます2。化合物を胃管投与する場合は、未溶解物質を含む懸濁液が許容されますが、静脈内投与には完全に溶解した溶質が重要です。.油性溶液、懸濁液、およびエマルジョンは毛細血管塞栓症を引き起こす可能性があるため、特に静脈内、筋肉内、腹腔内注射を投与する場合は、化合物調製用の水溶液が推奨されます3。
有効用量範囲は化合物間、および同じ化合物で治療された疾患間でも異なります。.有効用量および安全用量および濃度の決定は、文献および予備実験に依存する4。ここでは、化合物ナリンゲニンの調製が一例として実証される。
ポリフェノール化合物であるナリンゲニン(4,5,7-トリヒドロキシフラバノン)は、肝保護活性5、抗糖尿病6、抗炎症7、および抗酸化活性8の疾患治療で研究されています。インビボ用途では、ナリンゲニンの経口投与が一般的に使用されます。以前の研究では、0.5%〜1%カルボキシメチルセルロース、0.5%メチルセルロース用量、0.01%DMSO、および生理食塩水(PS)でナリンゲニン溶液を50〜100 mg / kgで調製し、経口強制投与で投与したと報告されています9,10,11,12。.その上、他の研究は、3.6 g / kg / d13,14の用量で経口摂取のために3%(wt / wt)でチャウチャウでナリンゲニンを補給することを報告しています。研究では、エタノール(0.5%v / v)、PS、およびDMSOを使用して、腹腔内注射用のナリンゲニンを10〜50 mg / kgで溶解することも報告されています15,16,17,18。側頭葉てんかんの研究では、マウスはPS19に溶解した0.25%カルボキシメチルセルロースに懸濁したナリンゲニンの注射を受けた。これらの研究では、ナリンゲニン溶液を調製するためのさまざまな溶媒の使用が報告されていますが、溶解状態や動物の反応などの詳細は報告されていません。.
このプロトコルは、糖尿病誘発性骨粗鬆症におけるin vivo適用のためのナリンゲニン溶液を調製するための手順を導入する。注射液の調製には、溶媒および化合物の調製、投与量推定、溶解プロセス、および濾過が含まれる。投与量は、文献研究および予備実験に基づいて、毎日3日間注射を投与した後にマウスを監視し、マウスの行動に応じて投与量を変更することにより決定した。最終的に選択された濃度(20 mg / kg b.w.)は、高脂肪食およびストレプトゾトシン(STZ)誘発糖尿病マウス20,21で週5日、8週間腹腔内投与されました。糖尿病性骨粗鬆症におけるナリンゲニンの効果は、血糖値検査、マイクロCT、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって評価されました。
全体として、40〜400 mg / mLの濃度範囲のナリンゲニンは、エタノールまたはDMSOまたは5%(エタノールまたはDMSO)と95%PS(v / v)のいずれにも完全に溶解しないことが観察されました。しかしながら、ナリンゲニンは3.52%DMSO、3.52%トゥイーン80、および92.96%PSの混合物に完全に溶解した。詳細な手順は、研究者が in vivo アプリケーション用の注射溶液として化合物を調製するのに役立ちます。
Protocol
Representative Results
Discussion
植物化学溶液の調製は、 インビボでのその適用の基礎である。このプロトコルでは、ナリンゲニン溶液の調製は、エタノール、DMSO、Tween 80、および0.9%PSなどの異なる溶媒を使用することによって実証されました。完全に溶解した状態の溶液は、室温で長時間放置し、 その後、in vivoで使用する前にろ過して、さらに監視する必要があります。
溶媒測定は、?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学財団(81973607および81573992)の支援を受けました。
Materials
| 1.5 mL microtubes | Corning Science (Wujiang) Co. | 23218392 | Holding liquid |
| Automatic Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA ASP 300S | Dehydrate samples |
| Blood glucose test strips | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | 4130392 | |
| Centrifuge | MIULAB | Minute centrifuge | Centrifugal solution |
| Dehydrator | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA ASP300S | Dehydration |
| DMSO | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E918BA0041 | Co-Solvent |
| ELISA assay kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | Mouse COL1(Collagen Type I) ELISA Kit: E-EL-M0325c Mouse CTX I ELISA Kit: E-EL-M0366c Mouse PICP ELISA Kit: E-EL-M0231c Mouse PINP ELISA Kit: E-EL-M0233c |
|
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009218 | Co-Solvent |
| Ethylene glycol monoethyl ether | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | A501118-0500 | TRAP staining |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10009617 | Decalcification |
| Filter | Merck Millpore LTD. | Millex-GP, 0.22 µm | filter solution |
| Glacial acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10000218 | TRAP staining |
| Glucose meter | Johnson & Johnson (China) Medical Equipment Co. | One Touch Ultra Vue | Serial number:COJJG8GW |
| Grinder | Shanghaijingxin Experimental Technology | Tissuelyser-24 | |
| Hematoxylin | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | D005 | TRAP staining |
| Insulin syringe | Shanghai Kantaray Medical Devices Co. | 0.33 mm x 13 mm, RW LB | Intraperitoneal injection |
| L-(+) tartaric acid | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 100220008 | TRAP staining |
| Microscope | OLYMPUS | sz61 | Observation |
| Microtome | Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co. | LEICA RM 2135 | Section |
| Mini centrifuge | Hangzzhou Miu Instruments Co., Ltd. | Mini-6KC | Centrifuge |
| Naphthol AS-BI phosphate | SIGMA-ALDRICH | BCBS3419 | TRAP staining |
| Naringenin | Jiangsu Yongjian Pharmaceutical Co.,Ltd | 102764 | Solute |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems (Shanghai) Co. | LEICA EG 1150 H, LEICA EG 1150 C | Embed samples |
| Pararosaniline base | BBI Life Sciences | E112BA0045 | TRAP staining |
| Pipettes | eppendorf | 2–20 µL, 100–1000 µL, 20–200 µL | transferre Liquid |
| Plate reader | BioTek Instruments USA, Inc. | BioTek CYTATION 3 imaging reader | ELISA |
| Resin | Shanghai Yyang Instrument Co., Ltd. | Neutral balsam | TRAP staining |
| saline (0.9 PS) | Baxter Healthcare (Shanghai) Co.,Ltd | A6E1323 | Solvent |
| Sodium acetate anhydrous | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | Merck-1.06268.0250 | 250g | TRAP staining |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd | 10020018 | TRAP staining |
| Tween-80 | Sangon Biotech (Shanghai ) Co.,Ltd. | E819BA0006 | Emulsifier |
| Zirconia beads | Shanghaijingxin Experimental Technology | 11079125z 454g | Grinding |
References
- Stoye, D. Solvents. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Bouchard, D., et al. Optimization of the solvent-based dissolution method to sample volatile organic compound vapors for compound-specific isotope analysis. Journal of Chromatography A. 1520, 23-34 (2017).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science: JAALAS. 50 (5), 600-613 (2011).
- Vandenberg, L. N., et al. Hormones and endocrine-disrupting chemicals: low-dose effects and nonmonotonic dose responses. Endocrine Reviews. 33 (3), 378-455 (2012).
- Hernández-Aquino, E., Muriel, P. Beneficial effects of naringenin in liver diseases: Molecular mechanisms. World Journal of Gastroenterology. 24 (16), 1679-1707 (2018).
- Den Hartogh, D. J., Tsiani, E. Antidiabetic properties of naringenin: A citrus fruit polyphenol. Biomolecules. 9 (3), (2019).
- Tutunchi, H., Naeini, F., Ostadrahimi, A., Hosseinzadeh-Attar, M. J. Naringenin, a flavanone with antiviral and anti-inflammatory effects: A promising treatment strategy against COVID-19. Phytotherapy Research. 34 (12), 3137-3147 (2020).
- Zaidun, N. H., Thent, Z. C., Latiff, A. A. Combating oxidative stress disorders with citrus flavonoid: Naringenin. Life Sciences. 208, 111-122 (2018).
- Tsuhako, R., Yoshida, H., Sugita, C., Kurokawa, M. Naringenin suppresses neutrophil infiltration into adipose tissue in high-fat diet-induced obese mice. Journal of Natural Medicines. 74 (1), 229-237 (2020).
- Annadurai, T., et al. Antihyperglycemic and anti-oxidant effects of a flavanone, naringenin, in streptozotocin-nicotinamide-induced experimental diabetic rats. Journal of Physiology and Biochemistry. 68 (3), 307-318 (2012).
- Li, S., et al. Naringenin improves insulin sensitivity in gestational diabetes mellitus mice through AMPK. Nutrition & Diabetes. 9 (1), 28 (2019).
- Devan, S., Janardhanam, V. A. Effect of Naringenin on metabolic markers, lipid profile and expression of GFAP in C6 glioma cells implanted rat’s brain. Annals of Neurosciences. 18 (4), 151-155 (2011).
- Burke, A. C., et al. Naringenin enhances the regression of atherosclerosis induced by a chow diet in Ldlr-/- mice. Atherosclerosis. 286, 60-70 (2019).
- Assini, J. M., et al. Naringenin prevents obesity, hepatic steatosis, and glucose intolerance in male mice independent of fibroblast growth factor 21. Endocrinology. 156 (6), 2087-2102 (2015).
- Alifarsangi, A., Esmaeili-Mahani, S., Sheibani, V., Abbasnejad, M. The citrus flavanone naringenin prevents the development of morphine analgesic tolerance and conditioned place preference in male rats. The American Journal of Drug and Alcohol Abuse. 47 (1), 43-51 (2020).
- Sirovina, D., Oršolić, N., Gregorović, G., Končić, M. Z. Naringenin ameliorates pathological changes in liver and kidney of diabetic mice: a preliminary study. Archives of Occupational Hygiene and Toxicology. 67 (1), 19-24 (2016).
- Nguyen-Ngo, C., Willcox, J. C., Lappas, M. Anti-diabetic, anti-inflammatory, and anti-oxidant effects of Naringenin in an In vitro human model and an in vivo murine model of gestational diabetes mellitus. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (19), 1900224 (2019).
- Ahmed, L. A., Obaid, A. A. Z., Zaki, H. F., Agha, A. M. Naringenin adds to the protective effect of L-arginine in monocrotaline-induced pulmonary hypertension in rats: favorable modulation of oxidative stress, inflammation and nitric oxide. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 62, 161-170 (2014).
- Park, J., et al. Naringenin ameliorates kainic acid-induced morphological alterations in the dentate gyrus in a mouse model of temporal lobe epilepsy. Neuroreport. 27 (15), 1182-1189 (2016).
- Matsui, H., et al. Early-stage Type 2 diabetes mellitus impairs erectile function and neurite outgrowth from the major pelvic ganglion and downregulates the gene expression of neurotrophic factors. Urology. 99, 1-7 (2017).
- Sharma, G., Ashhar, M. U., Aeri, V., Katare, D. P. Development and characterization of late-stage diabetes mellitus and -associated vascular complications. Life Sciences. 216, 295-304 (2019).
- Rowe, R. C., Sheskey, P. J., Owen, S. C. . Handbook of Pharmaceutical Excipients. , (2003).
- Fallahi, F., Roghani, M., Moghadami, S. Citrus flavonoid naringenin improves aortic reactivity in streptozotocin-diabetic rats. Indian Journal of Pharmacology. 44 (3), 382-386 (2012).
- Liu, F., Yang, H., Zhou, W. Comparison of the characteristics of induced and spontaneous db/db mouse models of type 2 diabetes mellitus. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica. 22 (6), 54-59 (2014).
- Liu, S., Dong, J., Bian, Q. A dual regulatory effect of naringenin on bone homeostasis in two diabetic mice models. Traditional Medicine and Modern Medicine. 03 (02), 101-108 (2020).
- Sun, C., Wu, Z., Wang, Z., Zhang, H. Effect of ethanol/water solvents on phenolic profiles and anti-oxidant properties of beijing propolis extracts. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, 595393 (2015).
- Huaman-Castilla, N. L., et al. The impact of temperature and ethanol concentration on the global recovery of specific polyphenols in an integrated HPLE/RP process on carménère pomace extracts. Molecules. 24 (17), (2019).
- van Thriel, C. Toxicology of solvents (including alcohol). Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
- Linakis, J. G., Cunningham, C. L. Effects of concentration of ethanol injected intraperitoneally on taste aversion, body temperature, and activity. Psychopharmacology. 64 (1), 61-65 (1979).
- Magwaza, L. S., et al. Rapid methods for extracting and quantifying phenolic compounds in citrus rinds. Food Science & Nutrition. 4 (1), 4-10 (2016).
- Smith, E. R., Hadidian, Z., Mason, M. M. The single–and repeated–dose toxicity of dimethyl sulfoxide. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 96-109 (1967).
- Colucci, M., et al. New insights of dimethyl sulphoxide effects (DMSO) on experimental in vivo models of nociception and inflammation. Pharmacological Research. 57 (6), 419-425 (2008).
- Kawakami, K., Oda, N., Miyoshi, K., Funaki, T., Ida, Y. Solubilization behavior of a poorly soluble drug under combined use of surfactants and co-solvents. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 28 (1-2), 7-14 (2006).
