घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर कोशिकाओं में फ्लोक्स्ड एलील के पूर्व विवो पृथक्करण द्वारा ट्यूमरजेनेसिस में जीन कार्यों को परिभाषित करना
Summary
यहां, हम जीन नॉकआउट करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल-व्युत्पन्न ट्यूमर में विवो में भ्रूण घातक होते हैं और फिर ट्यूमर के विकास, प्रसार, अस्तित्व, प्रवासन, आक्रमण और इन विट्रो और विवो में ट्रांसक्रिप्टोम पर नॉकआउट के प्रभाव का आकलन करते हैं।
Abstract
नई दवाओं का विकास जो मानव कैंसर में प्रमुख प्रोटीन को सटीक रूप से लक्षित करता है, मौलिक रूप से कैंसर चिकित्सीय को बदल रहा है। हालांकि, इन दवाओं का उपयोग करने से पहले, उनके लक्ष्य प्रोटीन को विशिष्ट कैंसर प्रकारों में चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में मान्य किया जाना चाहिए। यह सत्यापन अक्सर कैंसर के आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस (जीईएम) मॉडल में उम्मीदवार चिकित्सीय लक्ष्य को एन्कोडिंग करने वाले जीन को खटखटाकर और यह निर्धारित करके किया जाता है कि ट्यूमर के विकास पर इसका क्या प्रभाव पड़ता है। दुर्भाग्य से, पारंपरिक नॉकआउट में भ्रूण घातकता और सशर्त नॉकआउट में मोज़ेकवाद जैसे तकनीकी मुद्दे अक्सर इस दृष्टिकोण को सीमित करते हैं। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, जीईएम मॉडल में उत्पन्न घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (एमपीएनएसटी) की अल्पकालिक संस्कृतियों में रुचि के एक फ्लोक्स्ड भ्रूण घातक जीन को कम करने के लिए एक दृष्टिकोण विकसित किया गया था।
यह पत्र वर्णन करता है कि उपयुक्त जीनोटाइप के साथ एक माउस मॉडल कैसे स्थापित किया जाए, इन जानवरों से अल्पकालिक ट्यूमर संस्कृतियों को प्राप्त किया जाए, और फिर एक एडेनोवायरल वेक्टर का उपयोग करके फ्लॉक्स्ड भ्रूण घातक जीन को कम किया जाए जो क्रे रीकॉम्बिनेज और बढ़े हुए हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) को व्यक्त करता है। प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके एडेनोवायरस के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं की शुद्धि और सेलुलर प्रसार, व्यवहार्यता, ट्रांसक्रिप्टोम और ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट विकास पर जीन पृथक्करण के प्रभावों की मात्रा का ठहराव तब विस्तृत है। ये पद्धतियां इन विट्रो और विवो में चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने और मान्य करने के लिए एक प्रभावी और सामान्यीकृत दृष्टिकोण प्रदान करती हैं। ये दृष्टिकोण कम इन विट्रो विकास कलाकृतियों के साथ कम-मार्ग ट्यूमर-व्युत्पन्न कोशिकाओं का एक नवीकरणीय स्रोत भी प्रदान करते हैं। यह लक्षित जीन की जैविक भूमिका को विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं जैसे कि प्रवास, आक्रमण, मेटास्टेसिस और स्राव द्वारा मध्यस्थता वाले अंतरकोशिकीय संचार में अध्ययन करने की अनुमति देता है।
Introduction
पिछले दो दशकों से पहले, मानव कैंसर का उपचार रेडियोथेरेपी और कीमोथेरेप्यूटिक एजेंटों पर बहुत अधिक निर्भर था जो डीएनए को नुकसान पहुंचाकर या डीएनए संश्लेषण को बाधित करके तेजी से बढ़ती सेलुलर आबादी को लक्षित करते थे। यद्यपि इन दृष्टिकोणों ने कैंसर कोशिका वृद्धि को बाधित किया, लेकिन आंतों के उपकला कोशिकाओं और बालकूप कोशिकाओं जैसे सामान्य तेजी से फैलने वाले सेल प्रकारों पर उनके हानिकारक दुष्प्रभाव भी थे। हाल ही में, कैंसर थेरेपी ने कीमोथेरेप्यूटिक एजेंटों का उपयोग करना शुरू कर दिया है जो सिग्नलिंग मार्गों के भीतर प्रोटीन को सटीक रूप से लक्षित करते हैं जो व्यक्तिगत रोगी के नियोप्लाज्म के विकास के लिए गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं। इस दृष्टिकोण, जिसे आमतौर पर “प्रेसिजन मेडिसिन” के रूप में जाना जाता है, ने मोनोक्लोनल एंटीबॉडी और छोटे आणविक अवरोधकों के कभी-कभी विस्तारित प्रदर्शनों की सूची के विकास का नेतृत्व किया है। ये एजेंट पारंपरिक कीमोथेरेप्यूटिक एजेंटों और रेडियोथेरेपी के साथ देखे जाने वाले सामान्य सेल प्रकारों पर हानिकारक दुष्प्रभावों से परहेज करते हुए ट्यूमर सेल प्रसार और अस्तित्व को प्रभावी ढंग से रोकते हैं। मानव कैंसर के उपचार के लिए उपयोग किए जाने वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी आमतौर पर कोशिका सतह के अणुओं को लक्षित करते हैं जैसे कि विकास कारक रिसेप्टर्स1 (उदाहरण के लिए, झिल्ली-फैले रिसेप्टर टायरोसिन किनेसेस का बड़ा परिवार) और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मॉड्यूलेटर2 (जैसे, प्रोग्राम्ड सेल डेथ प्रोटीन 1, प्रोग्राम्ड डेथ-लिगैंड 1)। छोटे आणविक अवरोधक या तो कोशिका सतह प्रोटीन या सिग्नलिंग प्रोटीन को बाधित कर सकते हैं जो इंट्रासेल्युलर रूप से स्थित हैं3. हालांकि, इन नए चिकित्सीय एजेंटों को प्रभावी ढंग से नियोजित करने के लिए, यह स्थापित किया जाना चाहिए कि एक विशेष कैंसर उस अणु पर निर्भर है जिसे उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंट द्वारा लक्षित किया जा रहा है।
यद्यपि इन नए चिकित्सीय एजेंटों के अधिक केंद्रित प्रभाव हैं, उनमें से कई अभी भी एक से अधिक प्रोटीन की कार्रवाई को रोकते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग प्रभावशीलता और विशिष्टता वाले कई एजेंट अक्सर एक विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने के लिए उपलब्ध होते हैं। नतीजतन, प्रीक्लिनिकल जांच के दौरान, चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उम्मीदवार प्रोटीन को मान्य करने के लिए आनुवंशिक पृथक्करण जैसे अतिरिक्त दृष्टिकोणों का उपयोग करना बुद्धिमानी है। एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में एक प्रोटीन को मान्य करने के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी दृष्टिकोण आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल में उम्मीदवार प्रोटीन को एन्कोडिंग जीन को कम करना है जो विशिष्ट कैंसर प्रकार की रुचि विकसित करता है। यह दृष्टिकोण अपेक्षाकृत सरल हो सकता है यदि एक शून्य उत्परिवर्तन वाले चूहे (या तो एक प्राकृतिक उत्परिवर्तन, एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर शून्य उत्परिवर्तन [एक “नॉकआउट”], या जीन जाल द्वारा पेश किया गया एक शून्य उत्परिवर्तन) उपलब्ध हैं, और चूहे वयस्कता में व्यवहार्य हैं। दुर्भाग्य से, इन मानदंडों को पूरा करने वाले शून्य उत्परिवर्तन वाले चूहे अक्सर उपलब्ध नहीं होते हैं, आमतौर पर क्योंकि शून्य उत्परिवर्तन के परिणामस्वरूप भ्रूण या प्रसवोत्तर जीवन के पहले दिनों में मृत्यु हो जाती है। इस परिस्थिति में, ट्यूमर प्रकार की रुचि विकसित करने के लिए प्रवण चूहों को चूहों को पार किया जा सकता है जिसमें ब्याज के जीन के प्रमुख खंडों को लॉक्सपी साइटों (“फ्लोक्स”) द्वारा फ्लैंक किया जाता है, जो ट्यूमर कोशिकाओं (एक सशर्त नॉकआउट) में क्रे पुन: संयोजकता को व्यक्त करने वाले ट्रांसजीन को पेश करके जीन को कम करने की अनुमति देता है। यह दृष्टिकोण कई फायदे प्रदान करता है। सबसे पहले, यदि एक क्रे ड्राइवर उपलब्ध है जो ट्यूमर में व्यक्त किया जाता है, लेकिन सेल प्रकार में नहीं जो पारंपरिक नॉकआउट में मृत्यु का कारण बनता है, तो यह दृष्टिकोण संभावित रूप से उम्मीदवार चिकित्सीय लक्ष्य को मान्य कर सकता है। दूसरा, ट्यूमर कोशिकाओं में उम्मीदवार प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन को कम करना, लेकिन ट्यूमर से जुड़े फाइब्रोब्लास्ट या प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे अन्य इंट्राट्यूमोरल तत्वों में नहीं, अन्वेषक को चिकित्सीय लक्ष्य के सेल-स्वायत्त और गैर-सेल-स्वायत्त प्रभावों के बीच अंतर करने की अनुमति देता है। अंत में, एक टैमोक्सीफेन-इंड्यूसिबल क्रे ड्राइवर (सीआरईईआरटी 2) अन्वेषक को ट्यूमर के विकास में विभिन्न चरणों में ब्याज के जीन को हटाने और उस खिड़की को परिभाषित करने की अनुमति देता है जिसमें उम्मीदवार चिकित्सीय एजेंट प्रभावी होने की सबसे अधिक संभावना है।
दुर्भाग्य से, ऐसे तकनीकी मुद्दे भी हैं जो जीईएम मॉडल में उत्पन्न होने वाले ट्यूमर में सशर्त नॉकआउट के उपयोग को सीमित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, एक क्रे ड्राइवर जो ट्यूमर कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है और जीवन के लिए आवश्यक सामान्य कोशिकाओं में जीन विलोपन से बचा जाता है, उपलब्ध नहीं हो सकता है। एक और मुद्दा, जिसे कम करके आंका जा सकता है, यह है कि क्रे और क्रीयरटी 2 ड्राइवर अक्सर चूहों में फ्लॉक्स्ड एलील को अलग-अलग रूप से कम करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप जीईएम कैंसर में शून्य उत्परिवर्तन के लिए मोज़ेकवाद होता है। जब ऐसा होता है, तो ट्यूमर कोशिकाएं जिनमें लक्षित जीन को कम नहीं किया गया है, तेजी से फैलता रहेगा, ट्यूमर कोशिकाओं को एब्लेटेड एलील के साथ बढ़ा देगा। क्रे ड्राइवर लाइनों में मोज़ेकवाद लक्षित वंश में गैर-सर्वव्यापी क्रे अभिव्यक्ति के कारण हो सकता है और क्रे अभिव्यक्ति 4 से स्वतंत्र व्यक्तिगत कोशिकाओं में असफल पुनर्संयोजन द्वारा हो सकताहै। यह क्रे ड्राइवरों की एक ज्ञात घटना है जो सेल-प्रकार पर निर्भर है और प्रयोगात्मक डिजाइन और डेटा व्याख्या के दौरान विचार किया जाना चाहिए। मोज़ेकवाद नॉकआउट के प्रभाव को मुखौटा कर सकता है और एक अन्वेषक को गलत तरीके से निष्कर्ष निकालने के लिए प्रेरित कर सकता है कि ब्याज का जीन ट्यूमर सेल प्रसार और / या अस्तित्व के लिए आवश्यक नहीं है और इस प्रकार एक वैध चिकित्सीय लक्ष्य नहीं है।
इनमें से कई समस्याओं का सामना पिछले अध्ययन में किया गया था जिसने यह निर्धारित करने का प्रयास किया था कि क्या रिसेप्टर टायरोसिन किनेज ईआरबीबी 4 एमपीएनएसटी कोशिकाओं में एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य था5. इन अध्ययनों में, चूहों का उपयोग किया गया था जो श्वान सेल-विशिष्ट माइलिन प्रोटीन शून्य प्रमोटर (पी 0-जीजीएफβ3 चूहों) के नियंत्रण में न्यूरेगुलिन -1 (एनआरजी 1) आइसोफॉर्म ग्लियाल ग्रोथ फैक्टर-β3 (जीजीएफβ3)को एन्कोडिंग करने वाले ट्रांसजीन को व्यक्त करते हैं। पी0-जीजीएफ β3 चूहों में कई प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफाइब्रोमा विकसित होते हैं जो एक प्रक्रिया के माध्यम से एमपीएनएसटी बनने के लिए प्रगति करते हैं जो ऑटोसोमल प्रमुख ट्यूमर संवेदनशीलता सिंड्रोम न्यूरोफाइब्रोमैटोसिस टाइप 1 (एनएफ 1) 6 वाले रोगियों में न्यूरोफाइब्रोमा रोगजनन और प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफाइब्रोमा-एमपीएनएसटी प्रगति की प्रक्रियाओं को दोहराता है। जब एक टीआरपी 53 शून्य उत्परिवर्तन के साथ चूहों को पार किया जाता है, तो परिणामस्वरूप पी 0-जीजीएफβ3; टीआरपी 53 +/- चूहों में एमपीएनएसटी डे नोवो विकसित होता है जैसा कि सीआईएस-एनएफ 1 +/- में देखा जाता है; टीआरपी 53 +/- चूहों।
ये एमपीएनएसटी विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ग्रेड II से डब्ल्यूएचओ ग्रेड IV घावों में मनुष्यों में देखी गई प्रगति कोदोहराते हैं। पी0-जीजीएफ β3 चूहों में, एमपीएनएसटी ट्राइजेमिनल तंत्रिका (58%) और रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय तंत्रिका जड़ों (68%) में पहले से मौजूद प्लेक्सीफॉर्म न्यूरोफाइब्रोमा के भीतर उत्पन्न होते हैं; पी0-जीजीएफβ3 में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी; टीआरपी 53 +/- चूहों का अत्यधिक समान वितरण होता है। मनुष्यों में, एमपीएनएसटी सबसे अधिक कटिस्नायुशूल तंत्रिका में उत्पन्न होते हैं, इसके बाद ब्रैकियल प्लेक्सस, रीढ़ की हड्डी की तंत्रिका जड़ें, योनि, ऊरु, माध्यिका, त्रिक जाल, पॉप्लिटियल ओब्यूरेटर, और पीछे टिबियल और उलनार तंत्रिकाएं8. इन जीईएम मॉडल में यह ट्यूमर वितरण मनुष्यों में देखी जाने वाली चीज़ों से कुछ अलग है। हालांकि, पी0-जीजीएफβ3 और पी 0-जीजीएफβ3 में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी; टीआरपी 53 +/- चूहे हिस्टोलॉजिकल रूप से मानव एमपीएनएसटी के समान होते हैं, मानव एमपीएनएसटी में देखे गए कई समान उत्परिवर्तन ों को ले जाते हैं, और एनएफ 1 रोगियों में देखे गए न्यूरोफाइब्रोमा-एमपीएनएसटी प्रगति की प्रक्रिया को दोहराते हैं। पी 0-जीजीएफβ3 या पी0-जीजीएफβ3 की पीढ़ी; टीआरपी 53 +/- चूहे जो एआरबी 4-/- थे, संभव नहीं थे क्योंकि दो एआरबी 4 शून्य एलील वाले चूहे भ्रूण के दिन 10.5 माध्यमिक हृदय दोष 9 पर गर्भाशय में मर जातेहैं। क्योंकि हृदय-विशिष्ट एर्ब 4 ट्रांसजीन (α-मायोसिन भारी श्रृंखला (एमएचसी) –एआरबी 4) पेश करके दिल में एरबी 4 अभिव्यक्ति को बचाने के परिणामस्वरूप व्यवहार्य एर्ब 4-/- चूहे10, एक जटिल पी0-जीजीएफ β3 के साथ चूहों की पीढ़ी; टीआरपी 53 +/-; α-एमएचसी-ईआरबी 4; ईआरबी 4-/- जीनोटाइप का प्रयास किया गया था।
हालांकि, संभोग ने अपेक्षित मेंडेलियन अनुपात में चूहों का उत्पादन नहीं किया, यह दर्शाता है कि वांछित जीनोटाइप हानिकारक था। इसलिए, पी 0-जीजीएफβ3 की पीढ़ी; – फ्लॉक्स्ड एर्ब 4 एलील11 और एक क्रीयरटी 2 ड्राइवर के साथ चूहों को इन चूहों में उत्पन्न होने वाले एमपीएनएसटी में ईआरबी 4 को हटाने की अनुमति देने का प्रयास किया गया था। इन जानवरों में, बरकरार एर्ब 4 एलील के साथ कई ट्यूमर कोशिकाएं अभी भी मौजूद थीं (मोज़ेकवाद)। मनाया गया मोज़ेकवाद अक्षम टैमोक्सीफेन डिलीवरी के परिणामस्वरूप हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक के भीतर पुनर्संयोजन दक्षता में अंतर होता है। सहज प्रतिपूरक तंत्र की संभावना एर्ब 4 अभिव्यक्ति की आवश्यकता को दरकिनार करके टैमोक्सीफेन-मध्यस्थता पुनर्संयोजन में मोज़ेकवाद में योगदान दे सकती है। यह संभव है कि टीआरपी 53 का नुकसान ट्यूमर कोशिकाओं को अतिरिक्त सहज “अनुमेय” उत्परिवर्तनों के लिए अतिसंवेदनशील बनाता है जो डेटा की व्याख्या को भ्रमित कर सकते हैं। जैसा कि ऐसा लग रहा था कि एर्ब 4-बरकरार एमपीएनएसटी कोशिकाएं अन्य ट्यूमर कोशिकाओं में एआरबी 4 को खत्म करने के परिणामों को मुखौटा करेंगी, इस दृष्टिकोण को छोड़ दिया गया था।
इन बाधाओं ने बहुत शुरुआती मार्ग में ईआरबी 4 को खत्म करने के लिए एक पद्धति के विकास का नेतृत्व किया एमपीएनएसटी क्रे रिकॉम्बिनेज और ईजीएफपी को व्यक्त करने वाले एडेनोवायरस का उपयोग करके। इन कोशिकाओं को एफएसीएस का उपयोग करके गैर-संक्रमित कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है, जो स्पष्ट रूप से एब्लेटेड एर्ब 4 जीन के लिए मोज़ेकवाद को कम करता है। नीचे, इसे प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों, इन विट्रो और विवो में जीन पृथक्करण के प्रभावों का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का वर्णन किया गया है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल ट्यूमर असर चूहों है कि कैसे ट्यूमर असर चूहों है कि विवो एलोग्राफ्ट ट्यूमर विकास मूल्यांकन में से पहले पूर्व विवो छांटना के लिए ब्याज की भ्रूण घातक जीन के फ्लोक्स्ड एलील ले जाने ट्यूमर का उत्पादन करने का एक उदाहरण है। इसमें उस प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दृष्टिकोणों का वर्णन शामिल है जो एर्ब 4 पृथक्करण ट्यूमर सेल प्रसार, अस्तित्व और जीन अभिव्यक्ति पर इन विट्रो और प्रसार, अस्तित्व और ऑर्थोटोपिक एलोग्राफ्ट में एंजियोजेनेसिस पर डालता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां प्रस्तुत विस्तृत विधियों को एमपीएनएसटी के जीईएम मॉडल का उपयोग करके विकसित किया गया था। हालांकि, अगर ब्याज के ट्यूमर ऊतक को व्यक्तिगत कोशिकाओं में फैलाया जा सकता है, तो ये पद्धतियां जीईएम में उत्प…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिजीज एंड स्ट्रोक (आर 01 एनएस 048353, आर 01 एनएस 10 9 655), नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (आर 01 सीए 122804), रक्षा विभाग (एक्स 81 एक्सडब्ल्यूएच-09-1-0086, डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच -11-1-0498, डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच-12-1-0164, डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच-12-1-0164) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
|
Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
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